4-（苯乙烯基）苯酚的合成及抗肿瘤活性研究*

王 璇，姜晓晔，黎七雄

（武汉城市学院 医学部，湖北 武汉 430083）

二苯乙烯类天然产物广泛的存在于自然界中，具有抗菌[1]、抗氧化[2]、抗炎[3]、抗血小板凝聚[4]、抗衰老[5]、保护肝细胞[6]等多种生物活性，而近年来其展现出的抗肿瘤活性尤其引人关注[7-9]。在二苯乙烯类化合物中，白藜芦醇是一个经典的代表药物[10]，其在抗肿瘤方面被喻为是继紫杉醇后又一新的绿色抗癌药。然而，白藜芦醇在体内存在抗肿瘤效能低、选择性差、生物利用率低等缺点，使其临床应用受到了严格的限制。因此，开发出新型的、高效的白藜芦醇衍生物，已成为二苯乙烯类抗肿瘤药物研发的一个热点领域。目前，已有众多的白藜芦醇衍生物被报道[11-13]，其中部分衍生物的抗肿瘤活性甚至强于白藜芦醇。例如，在2013 年杜成[14]等合成的白藜芦醇衍生物抗HeLa 细胞增殖效果明显的强于白藜芦醇。

在本研究中，我们以（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯为原料，经过Wittig-Homor 反应以及BBr3脱甲基得到了一个白藜芦醇4-（苯乙烯基）苯酚（4），产物结构经过1H NMR 确证。同时考察了影响反应的因素，并优化了反应条件。随后，通过CCK-8 试剂盒评价了4-（苯乙烯基）苯酚对乳腺癌MCF-7、前列腺癌PC-3、宫颈癌HeLa 以及肝癌HepG2 细胞的抗肿瘤活性。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AV400 型核磁共振波谱仪（CDCl3为溶剂，TMS为内标，德国Bruker 公司）；OSB-2100 型旋转蒸发仪（上海爱朗仪器有限公司）；DZF-1 型真空干燥箱（上海市百典仪器厂）；DLSB-10/20 型低温冷却液循环泵（郑州长城科工贸有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工有限公司）；MS-H-ProA磁力搅拌器（大龙兴创实验仪器（北京）股份公司）；ELx800 型酶标仪（美国博腾仪器有限公司）。

（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯、4-甲氧基苯甲醛三溴化硼、N,N-二甲基甲酰胺，均为分析纯，购自百灵威科技有限公司；200～300 目柱层析硅胶，购自青岛海洋化工厂；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 实验方法

（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯（1）与4-甲氧基苯甲醛（2）发生Wittig-Homor 反应得到4-甲氧基二苯乙烯（3），（3）经BBr3脱甲基得到目标化合物4-（苯乙烯基）苯酚（4）。合成路线见图1。

图1 4-（苯基乙烯基）苯酚（1）的合成路线Fig.1 Synthetic route of 4-styrylphenol（4）

1.2.1 4-甲氧基二苯乙烯（3）的合成 将原料（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯（1）（45.6g，199.7mmol）溶解到200mL DMF 中，将反应液冷却到0℃，加入甲醇钠（5.0g，998.5mmol），保持低温搅拌10min，再加入4-甲氧基苯甲醛（32.6g，239.6mmol），溶液变成红色，保持室温反应12h。将反应液倾入2L 的冰水中，析出黄色固体，过滤，滤饼真空干燥后用无水乙醇进行重结晶得到白色固体4-甲氧基二苯乙烯（3）（38.4g，91.5%）。产物结构经1H NMR 确证。1H NMR（400MHz, CDCl3）δ 7.46～7.57（m, 4H）,7.40（t, J=7.2Hz,2H）,7.30～7.35（m，1H），7.14（d，J=16.4Hz，1H），7.12（d，J=16.0Hz，1H）,6.91（d，J=8.0Hz，2H），3.89（s，3H）。

1.2.2 4-（苯乙烯基）苯酚（4）的合成 无水无氧并在Ar 保护下，将4-甲氧基二苯乙烯（3）（18.4g，87.5mmol）溶解到200mL 二氯甲烷中，将反应液冷却至-20℃，滴加BBr3（65.7g，262.5mmol），-20℃继续反应12h。在反应液中滴加2mL 的甲醇淬灭反应，再将反应液倾入2L 的冰水中，析出白色固体，过滤，滤饼真空干燥后用无水乙醇进行重结晶得到黄色固体4-（苯乙烯基）苯酚（4）（38.4g，86.9%）。产物结构经1H NMR 确证。1H NMR（400MHz，DMSO-d6）δ 8.58（s，1H），7.55（d，J=7.6Hz，2H），7.45（d，J=8.8Hz，2H）,7.36（t，J=7.6Hz，2H），7.23（d，J=7.6Hz，1H），7.19（d，J=16.8Hz，1H），7.07（d，J=16.4Hz，1H），6.86 （d，J=8.8Hz, 2H）。

1.3 抗肿瘤活性

取对数期的MCF-7、PC-3、HeLa 和HepG2 细胞消化后铺至96 孔板中，用培养基调整每孔的细胞浓度为（8～10）×103个。在37℃5% CO2中培养箱中孵育12h，弃去培养液，加入不同浓度（0, 100, 50,25, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05μM）的4-（苯乙烯基）苯酚（4），继续孵育72h 后弃去培养液，每孔加入20μL CCK-8 溶液和180μL 的培养基，继续孵育4h，在酶标仪上使用470nm 波长读取每孔的吸光度（OD）值，计算出测试4-（苯乙烯基）苯酚的IC50值。

2 结果与讨论

2.1 结构表征

通过1H NMR 对目标化合物4-（苯基乙烯基）苯酚（1）进行了结构表征，见图2。

图2 4-（苯基乙烯基）苯酚（4）的氢谱Fig.2 1H NMR of 4-styrylphenol（4）

由图2 可见，化合物4-（苯基乙烯基）苯酚（4）具有一个-OH，其质子信号出现在低场，8.58×10-6处有一个单峰，并对应1 个H，这就是化合物1 中羟基的质子信号，表明通过BBr3已将4-甲氧基二苯乙烯（3）的甲基顺利脱去，得到了目标羟基化合物1；此外，化学位移在7.19×10-6和7.07×10-6处有两组双峰并各对应1 个H，且其耦合常数均大于16Hz，这是4-（苯基乙烯基）苯酚中乙烯基的2 个质子信号；同时化学位移在7.55×10-6、7.45×10-6、7.36×10-6、7.23×10-6、7.07×10-6和6.86×10-6附近总共出现9 个质子信号，这正是4-（苯基乙烯基）苯酚中两个苯环上9个H 的信号。

2.2 溶剂类型对化合物（3）收率的影响

在第一步Wittig-Homor 反应中，反应溶剂类型可能会影响收率。按照1.2.1 的操作方法，取（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯（1）（1.5g，6.6mmol）溶解到10mL不同溶剂中，再按照n（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯∶n甲醇钠=1∶5，加入甲醇钠（1.8g，33.0mmol）以及4-甲氧基苯甲醛（1.1g，7.9mmol）等反应条件不变情况下，考察溶剂对化合物（3）收率的影响。结果见表1。

表1 溶剂类型对化合物（3）收率的影响Tab.1 Effect of solvent type on the yield of compound（3）

由表1 可见，使用甲醇和乙醇做溶剂时，收率较低，这可能是由于这两种溶剂属于质子性溶剂，影响Wittig-Homor 反应的进行，造成化合物（3）收率低。四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺和18-冠-6-醚属于非质子性溶剂，其在反应中不会游离出质子，性质较稳定，因此，采用这3 种溶剂获得了高收率的化合物（3）。在这3 种非质子性溶剂中又以N，N-二甲基甲酰胺做溶剂获得了最高收率，而N，N-二甲基甲酰胺又易溶于水，可以通过多次水洗将其除去，所以确定此反应中溶剂选用N，N-二甲基甲酰胺最佳。

2.3 碱的类型对化合物（3）收率的影响

在第一步Wittig-Homor 反应中，碱的类型对化合物（3）收率有重要的影响。按照1.2.1 的操作方法，取（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯（1）（1.5g，6.6mmol）溶解到10mL DMF 中，加入5 个单量不同的碱以及4-甲氧基苯甲醛（1.1g，7.9mmol）等反应条件不变情况下，考察碱的类型对化合物（3）收率的影响。结果见表2。

表2 碱类型对化合物（3）收率的影响Tab.2 Effect of base type on the yield of compound（3）

由表2 可见，当甲醇钠作为碱时化合物（3）的收率最高。甲醇钠属于强碱，这表明，强碱可能有利于此反应。的确，当使用另外一种强碱叔丁醇钾时化合物（3）也有高的产率，但随着碱性的降低产率也随之降低，当采用中性的KCl 做催化剂时没有产生化合物（3）。因此，确定此反应中选用甲醇钠最佳。

2.4 物料比对化合物（3）收率的影响

在碱类型筛选实验中，确定了甲醇钠为最佳。接着探讨了n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇钠的物料比对反应的影响。按1.2.1 操作方法，取（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯（1）（1.5g，6.6mmol）溶解到10mL DMF 中，加入不同当量的甲醇钠以及4-甲氧基苯甲醛（1.1g，7.9mmol）等反应条件不变下，考察n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇钠对化合物（3）收率的影响。结果见表3。

表3 物料比对化合物（3）收率的影响Tab.3 Effect of mole ratio on the yield of compound（3）

由表3 可见，n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇钠=1∶5 时，化合物（3）的收率最高；当甲醇钠的当量小于5 时，由于反应不充分造成化合物（3）的产率低；而当甲醇钠的当量大于5 时，化合物（3）的产率也有所降低，这可能是由于过量的甲醇钠引发了副反应造成的，同时考虑到节约试剂成本问题，因此，确定此反应n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇钠=1∶5 为最佳投料比。

2.5 反应温度与时间对化合物（3）收率的影响

反应温度与时间对化合物（3）的产率也有一定的影响。按照1.2.1 的操作方法，取（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯（1）（1.5g，6.6mmol）溶解到10mL DMF 中，n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇钠=1∶5 以及4-甲氧基苯甲醛（1.1g，7.9mmol）等反应条件不变情况下，考察反应温度与时间对化合物（3）收率的影响。结果见表4。

表4 反应温度与时间对化合物（3）收率的影响Tab.4 Effect of reaction temperature and time on the yield of compound 3

由表4 可见，室温反应12h 时化合物（3）的收率最高；当反应时间缩短为8h，化合物（3）的收率明显降低，这可能是由于反应时间短，反应还未完全；当反应时间延长为24h 时，收率也没有显著地提高；此外，将反应温度由室温降为0℃，此时化合物（3）的收率降低；而当反应温度升高为60℃时，化合物（3）的收率较室温反应也有所降低，这可能是由于随着温度的升高副反应也增加所致。因此，确定此反应为室温反应12h 为最佳。

2.6 脱甲基试剂种类对目标化合物（4）收率的影响

在第二步脱甲基化反应中，脱甲基试剂种类对目标化合物（4）的收率也重要的影响。按照1.2.2 的操作方法，取4-甲氧基二苯乙烯（3）（1.3g，6.2mmol）采用不同的脱甲基试剂和反应条件来考察其对化合物（4）收率的影响。结果见表5。

表5 脱甲基试剂种类对化合物（4）收率的影响Tab.5 Effect of demethylating reagent on the yield of compound（4）

由表5 可见，采用以二氯甲烷作为溶剂、BBr3作为脱甲基试剂，在-20℃下反应脱甲基效果最佳，化合物（4）的产率达到了86.9%，而采用HBr、乙醇钠和AlCl3为脱甲基试剂得到的产率不足30%；尽管采用Al 和I2作为脱甲基试剂能够使得化合物（4）的产率达到84.1%，但考虑到I2是一种有毒物质，容易对身体造成损伤，所以在此反应中BBr3为最佳脱甲基试剂。

2.7 BBr3 的用量对目标化合物（4）收率的影响

在第二步脱甲基化反应中，确定了BBr3为最佳脱甲基试剂，n4-甲氧基二苯乙烯∶nBBr3的物料比可能对化合物（4）也有一定的影响。按照1.2.2 的操作方法，取4-甲氧基二苯乙烯（3）（1.3g，6.2mmol）溶解到15mL二氯甲烷中，-20℃下加入不同当量的BBr3来考察n4-甲氧基二苯乙烯∶nBBr3对化合物（4）收率的影响。结果见表6。

表6 物料比对化合物（4）收率的影响Tab.6 Effect of mole ratio on the yield of compound（4）

由表6 可见，n4-甲氧基二苯乙烯∶nBBr3=1∶3 时，化合物（4）的收率最高；当BBr3的当量小于3 时，由于脱甲基化试剂不够造成化合物（4）的产率低；而BBr3的当量大于3 时，BBr3用于脱甲基量过剩，而BBr3活性高易发生副反应造成产率降低，因此，确定此反应的n4-甲氧基二苯乙烯∶nBBr3=1∶3 为最佳投料比。

2.8 抗肿瘤活性

为了评价4-（苯乙烯基）苯酚4 的抗肿瘤效果，采用了CCK-8 试剂盒测试了其对MCF-7、PC-3、HeLa 和HepG2 这4 种肿瘤细胞的抑制活性。结果见表7。

表7 4-（苯乙烯基）苯酚4 的体外抗肿瘤活性（n=3）Tab.7 Anti-proliferative activity of 4-styrylphenol 4（n=3）

由表7 可见，4-（苯乙烯基）苯酚4 对MCF-7、PC-3、HeLa 和HepG2 肿瘤细胞均展现出了抑制活性，并对MCF-7 有更强的抑制活性，其IC50=（19.9±2.5）μmol·L-1。

3 结论

以（4-甲氧苯基）膦酸二乙酯（1）为原料，在甲醇钠催化下，与4-甲氧基苯甲醛（2）反应制得4-甲氧基二苯乙烯（3），（3）再经经BBr3脱甲基得到了4-（苯乙烯基）苯酚（4）。产物结构通过核磁共振氢谱表征。

优化了反应条件：在Wittig-Homor 反应中，N，N-二甲基甲酰胺（DMF）为溶剂；甲醇钠为催化剂；n(4-甲氧苯基)膦酸二乙酯∶n甲醇钠=1∶5；室温反应时间12h；在脱甲基化反应中：BBr3为催化剂；n4-甲氧基二苯乙烯∶nBBr3=1∶3；反应温度为-20℃。优化条件下产物总收率为79.5%。通过生物活性测试表明，4-（苯乙烯基）苯酚对MCF-7、PC-3、HeLa 和HepG2 均展现出了明显的抑制活性。这些结果表明，4-（苯乙烯基）苯酚可作为抗肿瘤先导化合物进行更深入的研究。