桃金娘水提物对小鼠经口给药急性和亚急性毒性研究

王河，黄鑫，陈少锋，杨增艳，梁丽清，谭蓓蓓

(1. 广西中医药大学附属国际壮医医院，广西 南宁 530200；2. 广西农业职业技术学院，广西 南宁 530007)

桃金娘(拉丁学名：Rhodomyrtustomentosa)，又称岗菍、山菍、菍子树等，为桃金娘科植物，桃金娘属矮小常绿灌木，在我国主要分布在南部各省，尤为广西、广东、台湾等地常见。系我国民间常用中药材，其全株和果实均可入药，具有活血通络、收敛解毒、补虚止血等功效[1]。《壮药选篇》[2]中记载，桃金娘根具有调龙路、火路，祛湿毒之功用；用于痹病(发旺)，黄疸(黄标)，崩漏(病淋勒)，头痛(巧尹)和腰肌劳损等。但其临床应用多停留在民间传统经验基础上，尤为基层畜牧兽医药用常见，用作治疗牛劳役过度、猪肠炎、猪牛风湿软脚、牛阉割后出血不止、仔猪和犊牛白痢等疾病[3]。桃金娘作为一种重要的中药植物，具有悠久的临床应用历史。近年来它的药用价值和营养特性广受国内外研究人员的重视。现代研究证明，其富含多酚类、黄酮类、三萜类和多糖类化合物[4]，且具有抗氧化[5]、抗炎[6-7]、抗菌[8-9]、抗癌[10]等生物活性，但其毒理学研究尚未有报道，安全性也未经科学验证。为探讨桃金娘根水提物的临床安全性，本研究利用小鼠进行了急性毒性和亚急性毒性试验，为桃金娘的开发利用和安全性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 药物

桃金娘鲜根采自广西南宁市武鸣区大明山，由广西民族医药研究院黄瑞松教授鉴定为桃金娘科植物桃金娘属的地下根。药材切片后自然晾干，粉碎成粗粉。称取250 g药粉，加8倍量水浸泡过夜，沸水提取2 h，过滤；滤渣加4倍量水，沸水提取2 h，过滤，合并滤液，水浴浓缩至5 g/mL浓度溶液，所得提取液置2～8 ℃冰箱保存备用。

1.2 实验动物

SPF级KM小鼠雌雄各半，体重18～22 g，购自广西医科大学(广西实验动物中心)，实验动物生产许可证号：SCXK桂2014-0002。将小鼠置于26 ℃室温，相对湿度60%左右的环境下，自然光照昼夜更替，给予标准动物饲料和纯化水喂养。试验前，全部小鼠在实验室条件下适应性驯养7 d。

1.3 主要试剂

戊巴比妥钠(北京诺博莱德)；天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总胆红素(T-Bil)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素(UREA)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)测定试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗有限公司。

1.4 急性经口毒性预试验

取小鼠18只，雌雄各半，并随机分成单日给药1次试验组、2次给药试验组和3次给药试验组，每组6只，禁食不禁水14 h后，以单位体重单次最大灌胃量(0.04 mL/g)给予桃金娘水提物(200 g/kg)，给小鼠灌胃。连续观察7 d，试验动物均无死亡，无法测出桃金娘水提物的LD50。

1.5 急性经口毒性试验

将24只小鼠，雌雄各半分笼饲养，随机分成雌性、雄性空白组，雌性、雄性给药组，每组6只。禁食不禁水14 h后，给药组小鼠以单位体重给药，最大灌胃体积(0.04 mL/g)经口给予桃金娘水提物(200 g/kg)，以6 h为间隔连续给药3次，空白组给予等体积的纯化水处理，建立阴性对照。给药后30 min内对所有动物进行密切观察;前4 h内至少30 min观察1次；24 h后每天观察1次，连续14 d。所有的观察包括小鼠皮毛、眼睛和黏膜的变化，以及给药后的运动和精神状况。此外，还观察抽搐、震颤、流涎、嗜睡、昏迷和死亡情况。每天记录摄食量，每周末记录小鼠体重。

1.6 亚急性经口毒性试验

将48只小鼠随机分成4组：桃金娘水提物高剂量组(9.1 g/kg)、中剂量组(4.55 g/kg)、低剂量组(2.27 g/kg)和空白对照组(纯化水)。每组12只，雌雄各半分笼饲养。每组小鼠以最大灌胃体积(0.04 mL/g)给予对应的药物经口给药，每日1次，连续给药28 d。给药后每天监测小鼠的生活状况，记录死亡率和食物消耗量，观察小鼠的中毒迹象。每周末记录各组小鼠体重[11]。

1.7 血清生化检测

每个试验结束时(急性经口毒性试验第15天，亚急性经口毒性试验第29天)，对所有动物腹腔注射戊巴比妥钠50 mg/kg,麻醉后摘眼球取血，血样放置在普通离心管中，室温下静置30 min，待血液凝固后，置4 ℃高速冷冻离心机，以4 500 r/min离心15 min，取上清液置全自动生化分析仪进行肝功能和肾功能相关指标含量分析。

1.8 病理检查

分别在试验结束时对急性和亚急性毒性试验的小鼠进行尸检。采血结束后，小鼠沿腹部中线解剖切除心、肝、脾、肺、肾五大重要器官，观察各脏器质地以及有无肉眼可见的病理变化，滤纸吸干器官表面血液后称重。根据公式计算脏器指数[12]：

相对器官重量(脏器指数)=(绝对器官重量/死前体重)×100%。

如果肉眼观察有病变且脏器指数与空白组比较有显著差异，则进一步做病理切片检查。

1.9 统计学分析

采用SPSS 26.0统计学软件对数据进行单因素ANOVA检验，LSD多重比较。结果用“平均值±标准差”表示。P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。

2 结果

2.1 生命体征和行为分析

在整个急性和亚急性经口毒性试验研究过程中，小鼠均未出现死亡。急性试验组给予桃金娘水提物后前4 h，所有小鼠粪便呈暗棕色与药物颜色相近，个别小鼠出现便溏现象，且该组小鼠表现为倦怠、活动减少、不思饮食，4 h后上述症状慢慢消失，第2天恢复正常与空白组生活状况无差异。2个试验组小鼠未出现因给药而产生的严重中毒事件发生。整个观察过程中，所有小鼠的皮毛、呼吸系统，内分泌系统和神经系统均未出现明显异常。

2.2 摄食量和体重变化

给药后每隔7 d对各组小鼠摄食量和体重做1次统计分析，急性和亚急性经口毒性试验中各给药组和空白组的小鼠体重均有逐渐增长趋势，与空白组相比给药组的体重变化无显著差异(P>0.05)。两项试验中，给药组的摄食量与空白组比较，除亚急性经口给药试验在第2周高剂量雄性组差异显著(P<0.05)外，其余各组均无显著差异(P>0.05)，详见表1～表3所示。

表1 桃金娘水提物急性经口毒性试验对小鼠体重及摄食量影响(n=6)

表2 桃金娘水提物亚急性经口毒性试验对小鼠体重的影响(n=6) g

表3 桃金娘水提物亚急性经口毒性试验对小鼠摄食量的影响(n=6) g/d

2.3 宏观脏器病变观察和脏器指数

在急性和亚急性两项经口毒性试验中，各组小鼠的脏器质地均匀、色泽鲜艳和外形正常，给药组未发现肉眼可见的病理变化。与空白组比较，给药组的脏器指数均无显著性差异(P>0.05)，如表4、表5所示。

表4 桃金娘水提物急性经口毒性试验小鼠脏器指数(n=6)

表5 桃金娘水提物亚急性经口毒性试验小鼠脏器指数(n=6)

2.4 血清生化检测

急性经口毒性试验空白组与给药组的生化检测参数结果见表6，给药组和空白组间生化指标差异不显著(P>0.05)；亚急性经口毒性试验空白组与各剂量给药组的生化检测参数结果见表7，各组间生化指标差异无统计学意义(P>0.05)。

表6 急性经口毒性试验血液学指标(n=6)

表7 亚急性经口毒性试验血液学指标(n=6)

3 讨论

长期以来植物药在我国民间具有悠久的使用历史和丰富的临床经验，其在人类疾病救治、健康保健以及畜牧业中具有非常广阔的开发前景[13]。然而在没有现代科学研究基础来充分支持药用植物的安全性和有效性的前提下，使用该植物治疗疾病潜在着很大的安全隐患。因此，通过科学的毒性研究方案来验证药用植物的安全性是非常有必要且重要的[12]。急性经口毒性试验作为一项最基本的对受试物进行风险评估的试验，既可用于急性化学品接触的危险分类，又可提供治疗期内经口接触受试物，可能潜在的危害健康信息，大部分化学品和中药材的安全性评价都会首先进行急性经口毒性试验[14]。然而，急性毒性得到的试验信息临床应用有限，因为即使在极少的剂量下也会发生积累性中毒效应。因此，同时开展多剂量、重复给药28 d的亚急性经口毒性研究更有助于评价植物药的安全性。

本研究的目的是，评价桃金娘地下根部分水提物经口给药后，对小鼠的急性和亚急性毒性作用，进而评价该药是否会对人类造成危害。结果表明，桃金娘水提物在急性和亚急性试验中，各组小鼠体重均呈增长趋势，且整个治疗过程中小鼠的精神状态和生活状况表现良好。除高剂量雄性组第2周摄食量下降显著外，其余各给药组与空白对照组小鼠之间的增重和摄食量没有显著差异。事后分析认为，可能是灌胃时刺激了小鼠食道造成的。在急性毒性试验中，按单位体重给药，给予小鼠最大单剂量200 g/kg，单日多次给药后小鼠无死亡，无法测出LD50，提示桃金娘水提物潜在有毒物质的可能性很低，且单日最大给药量为600 g/kg，相当于60 kg体重成年人临床日剂量的310倍。根据急性经口毒性试验数据使用分析，当LD50>5 000 mg/kg时，该受试物可归为最低毒性等级，因此，桃金娘水提取物的急性毒性分类可归类为第4类[15]，具有较低的急性毒性危害。

相对器官重量是评价药物是否存在毒性的高度敏感指标之一[16]。心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏是人类和啮齿类动物对摄入的物质产生代谢反应的首要器官。因此，评价这五大器官的相对器官重量有助于诊断受试物对代谢器官是否产生损害。在急性和亚急性经口毒性研究中，给药组和空白对照组小鼠的相对脏器指数未出现显著性差异，各组间内脏的大体观察其形状大小、颜色和质地也没有差异。初步认定桃金娘水提取物对心、肝、脾、肺和肾基本无毒。

血液生化指标是判断机体健康状况的一项重要依据[17]。肝脏是机体重要的解毒器官，肾脏则是重要排毒器官，通过分析肝功能和肾功能的变化是判定植物药安全性的重要指标。ALT主要存在肝组织中，而AST除了存在于肝脏外，还存在于心肌、骨骼肌、大脑和肾脏中[16]，ALT和AST均为重要的肝细胞内酶，正常情况下血清中的含量极低，当肝脏受损、肝细胞受到破坏时，酶外渗进入血液从而导致血清中的ALT、AST水平升高。因此，检测血清中该酶含量高低是评价肝细胞损伤和坏死程度的重要标志[18]。T-Bil由肝脏、脾脏和骨髓中的血红蛋白分解形成。而发生溶血、肝炎或肝损伤均可引起血清中的胆红素水平升高[19]。同时肝脏也是蛋白质合成的主要场所，当肝细胞受损，肝脏分泌功能障碍时会引起血清中TP、ALB和GLO水平的降低。本次研究数据显示，亚急性经口毒性试验中给药组雄性小鼠的血清AST数值有所升高，但仍在正常线性范围(4～800 U/L)，且急性和亚急性经口毒性试验的各给药组肝功能指标，与空白对照组比较均无显著性差异，因此桃金娘水提物在两项毒性研究中未影响小鼠肝细胞功能以及肝脏分泌功能。

尿素是机体内蛋白质代谢的终末产物，当肾实质受损时血清尿素浓度会升高，而发生中毒性肝炎时血清尿素则会降低；当肾脏功能受到损害，肾功能失代偿时血清肌酐水平上升，同时肾功能减退时常伴随着尿酸增高，因此尿素、肌酐和尿酸是作为毒性研究中评价肾功能损害的指标[20]。在急性和亚急性经口毒性试验中，血清中尿素、肌酐和尿酸水平没有明显变化，且给药组与空白对照组比较无显著性差异，因此可以认为桃金娘水提物无小鼠肾毒性。上述结果表明，桃金娘水提物在体重、器官重量、血清生化检查和宏观的器官病理检查方面均未发现毒性现象，可认为该植物药急性毒性小，安全性高。

综上所述，按照经口全身毒性药物分类等级，桃金娘根水提取物可归类为第4类，即最低毒性等级。其单日最大给药量达到600 g/kg，相当于成年人体最低临床日剂量的310倍，且对任何小鼠均未引起毒性反应。在亚急性经口毒性试验中每日给药剂量为9.1、4.55、2.27 g/kg，连续28 d，虽然雄性小鼠AST指标有所升高但仍在参考数值范围以内，其他考察指标未出现与中毒有关的反应，提示桃金娘根水提取物的耐受性好，安全性高。本次研究仅为急性毒性研究，为确定桃金娘根水提取物的口服安全治疗剂量，可能还需进行慢性毒性研究。