酶法米糠制取油脂及蛋白多肽工艺技术的研究*

2021-08-06于坤弘代雅杰江连洲于殿宇潘明喆

大豆科技 2021年2期

于坤弘，陈星，代雅杰，江连洲，于殿宇，潘明喆**，姚凯

（1.黑龙江北大荒丰威食品有限公司，哈尔滨 150010；2.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030；3.湖北天星粮油股份有限公司，湖北随州 431500）

在稻米加工的过程中，近60%的营养物质残留在米糠中不被利用[1]。其中，蛋白质含量为15%左右，是制备抗氧化、抗肥胖、抗血管增生、抗高血压等活性肽的良好来源；脂肪含量约为18%～23%，且多不饱和脂肪酸与单不饱和脂肪酸含量较高；无氮浸出物包括淀粉、纤维素和半纤维素等占33%～56%，部分半纤维素构成水溶性米糠多糖，糖类物质中寡糖链易与多肽链中的某些氨基酸残基以糖苷键共价相连形成糖蛋白。此外，米糠还富含维生素E、谷维素、甾醇等生物活性物质，因此被美国食品和药品管理局认定为它可以作为食品原料或配料，应用于全谷物食品、米糠主食、全谷物早餐等食品行业,米糠营养物质的提取和利用也成为一大研究热点。

但米糠脂肪酶的活性较强，在生产过程中易造成油脂腐败和蛋白质变性。目前国内外主要通过化学法、酶法[2]和物理法等高新技术钝化米糠中的脂肪酶，达到稳定米糠的作用，以此提高米糠的利用率。王蕾等[3]在纤维素酶酶解脱脂米糠的基础上，以碱溶酸沉法为辅助提取米糠蛋白，米糠蛋白的提取率最高为48.97%，纯度为74.43%。但化学法提取蛋白容易发生化学残留，且在反应过程中蛋白质易变性。超声空化效应在不破坏米糠细胞结构的基础上直接提取蛋白质，有利于获得纯度较高的蛋白质，与木瓜蛋白酶结合米糠蛋白的溶解度可达74.83%[4]，但由于超声设备昂贵，只适用于实验室研究。

挤压膨化作为一种物理方法[5-6]，主要是通过挤压机螺杆产生的推动力，使物料受到混合、搅拌和高剪切力作用，从而发生膨化。研究表明，挤压膨化对米糠中脂肪酶的活性有着明显的抑制作用，有利于米糠理化性质的稳定。因此，本研究选用通过挤压膨化钝化的新鲜全脂米糠为原料，探究了酶添加量、pH、酶解时间、酶解温度、液料比等因素对钝化新鲜全脂米糠提油率的影响，并考察了通过添加糖化酶酶解提油后的酶解底物，减少成品中的水溶性糖类物质，以提高米糠蛋白多肽产品的质量。

1 材料与方法

1.1 材料

钝化新鲜全脂米糠，湖北天星粮油股份有限公司；对硝基苯酚基月桂酸酯（p-NPL），山东西亚化学工业有限公司；Triton X-100，广州共庆化工有限公司；阿拉伯胶，上海联硕生物科技有限公司；纤维素酶：酶活力为700 EGU/g，诺维信公司提供，最适温度为50～60℃，最适pH为4.5～6.0；碱性蛋白酶200 000 U/g、糖化酶150 000 U/g，南宁庞博生物工程有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KTJ16型可调控的酶膜反应器Φ 1.6×2.0 m，酶膜使用5次，离心分离机，蒸发浓缩罐，蒸发能力200 kg/h，喷雾干燥塔SUS 304水分蒸发5 kg/h。

1.3 钝化全脂新鲜米糠

利用双螺杆挤压膨化机挤压，机筒温度130℃、螺杆转速160 r/min、模头孔径8 mm，对新鲜全脂米糠进行稳定化处理，得到钝化全脂新鲜米糠。

1.4 钝化全脂新鲜米糠的酶法提油

按照一定液料比添加水，用0.1 mol/L NaOH溶液和0.1 mol/L HCl溶液调节料液pH 4.0～8.0。料液温度为35～55℃时，添加一定量的酶，酶解2～6 h，酶解过程中保持混合液pH不变并不断搅拌，使物料充分被酶解。分离游离油和乳状液，将乳状液加热到95℃破乳分离，合并油项[7]。

1.5 米糠酶解物的糖化酶解

水酶法提油后的余下物质称为米糠酶解物，通过调整pH，加入一定量的糖酶，在一定温度、时间条件下，糖化米糠酶解物中的糖类物质，调整pH后离心分离，经浓缩喷雾干燥，得到米糠蛋白多肽。

1.6 脂肪酶活性测定

参考Laokuldilok[8]的方法。以p-NPL为底物，将适量酶液加入相应底物溶液中，混合物在35℃的振荡水浴中孵育20 min。通过煮沸5 min终止反应。离心后（台式离心机，6 000 r/min，10 min），在410 nm处测量澄清上清液的吸光度。一个单位（U）的酶活性被定义为在测定条件下每分钟释放1 000 PnP所需的酶量。

1.7 总糖测定

采用蒽酮-硫酸法[9]测定米糠中的总糖含量。用分析天平称量0.200 0蒽酮，加80%硫酸溶液溶解后置于容量瓶中定容。将样品溶液和葡萄糖标准品溶液于具塞试管中，加入蒽酮-硫酸溶液反应，以去离子水为空白对照，在500～900 nm范围内测定其吸光度值。

1.8 蛋白质分子质量测定

采用分子筛层析法确定米糠多肽的相对分子质量。将米糠蛋白肽溶液进行稀释，摇匀待用；制备标准多糖溶液和蓝色聚多糖溶液。用Sephade⁃xG-200填柱，待凝胶柱平衡后加入样品。当蓝色物质流出时，开始收集洗脱液。洗脱液进行稀释后，在490 nm下测吸光度代表标准葡聚糖的吸光度；在280 nm下吸光度值代表蛋白质的吸光度，可根据标准葡聚糖和米糠蛋白多肽的出峰位置计算蛋白质分子量。

1.9 水解度测定（DH）

采用 pH-stat法[10]。

式中，B为NaOH所用体积（mL）；N为NaOH浓度（mol/L）；MP为原料中蛋白质质量（g）；α为氨基酸平均解离常数；htot为每克原料蛋白质中含有肽键毫摩尔数。

1.10 蛋白质回收率计算

蛋白质回收量测定采用凯氏定氮法（GB/T 5009.5-2003)。

式中，m为上清液中蛋白质回收量（g）；M为蛋白质总量（g）。

1.11 蛋白酶酶活

采用Folin-酚法，采用分光光度计进行测定。取1 mL样品溶液（约含20～250 μg多肽或蛋白质），加入5 mL氢氧化铜溶液，混匀，于20～25℃放置10 min，再加入0.5 mL试剂乙（Folin氏试剂），立即振荡摇匀，在20～25℃保温30 min，然后于500 nm处比色。以1 mL水代替样品作为空白对照。

1.12 提油率

本试验将提油率定义为采用水酶法提取的游离油质量之和与米糠质量的百分比（%，g/g）。

1.13 油脂品质测定

酸值AV：参照GB/T 5530-2005测定；过氧化值PV：参照GB/T 5538-2005测定；

皂化值SV：参照GB T 5534-2008测定；碘值IV：参照GB/T 13892-2012；折光指数RI：参照GB/T 5527-2010。

1.14 蛋白质分散指数测定

蛋白质分散指数是一项衡量食物蛋白质功能性质的指标，为蛋白质中能在水中分散的蛋白质量占该蛋白质总量的百分比（%）。

1.15 谷维素测定

标准曲线绘制：称量0.020 8 g γ-谷维素，加入适量三氯乙烷进行溶解，用正己烷定容容量瓶中。标准工作液质量浓度分别为4.16、8.32、12.48、6.64、20.80 μg/mL，最大吸收波长315 nm。样品测定：取一定量分散均匀的AEE，加入二倍体积正己烷，于50℃恒温磁力搅拌水浴锅中萃取90 min，315 nm处测定上层正己烷吸光度，以正己烷为空白对照。

2 结果与讨论

2.1 米糠的特性

米糠经过40目筛去除原料米糠中的米粞，新鲜米糠感官指标性状如1表所示。

表1 新鲜米糠感官性状

挤压膨化米糠：膨化机筒温度130℃、螺杆转速160 r/min、模头孔径8 mm，出料温度为90℃，新鲜米糠质量及钝化全脂新鲜米糠特性见表2所示。

表2 新鲜米糠质量及钝化全脂新鲜米糠特性 %

通过双螺杆挤压膨化后，钝化全脂新鲜米糠脂肪酶残余活力降至3.84%，由于米糠脂肪酶的活性已被钝化，杜绝了后续酶解过程中脂肪酶的酶解，减少了对外加酶的干扰因素。同时挤压膨化处理，对米糠中的淀粉含量由19.67%，降到了15.38%，挤压膨化处理对米糠淀粉的影响见表3。

表3中直链淀粉含量基本没有发生变化，支链淀粉质量分数则下降了51%，且糊化度明显提高，表明挤压膨化机的高温、高剪切作用剧烈地破坏了淀粉原有的晶体结构，淀粉分子重新排列，由致密结构向疏松结构转变，有助于后续的酶法提取油脂和蛋白。

2.2 米糠的酶法提油

在碱性蛋白酶、纤维素酶组成的复合酶（1∶1，w/w）添加量2%、酶解时间5 h、酶解温度50℃、液料比5∶1、pH 6.0的条件下，对钝化全脂新鲜米糠进行酶解，经离心分离得到稻米油的质量见表4。

表4 稻米油物理化学性质

表4中钝化新鲜米糠制备的稻米油AV仅为7.45±0.31，说明挤压膨化极大地钝化了米糠中的脂肪酶活性，破坏脂肪层的结构，提高了稻米油的品质和贮存的稳定性。一般情况膨化机出料段膨化腔温度在120～130℃下，既可以使米糠中的脂肪酶、过氧化酶有效失活，又能使米糠中天然抗氧化物质减少，从而使米糠保鲜期延长，也为后续加工提供了优质原油，提油率可达到23.27%。