核转录因子-κB、细胞外信号调节激酶1/2、转移相关蛋白-3在乳腺肿瘤组织中的表达研究

马军伟，王 佳，宋 炜，白 洁

(延安大学附属医院肿瘤科，陕西 延安 716000)

乳腺肿瘤发病率高，每年新增患者167.1万，死亡率高，每年约有52.2万患者死亡[1，2]。我国乳腺肿瘤发病人数约占全球发病人数的12.2%，死亡率居恶性肿瘤第六位，且呈逐年上升趋势[3，4]。是否转移是评估乳腺肿瘤患者预后的重要影响指标，NF-κB、ERK1/2、MTA-3在乳腺肿瘤转移过程中发挥了重要作用[5，6]，但NF-κB、ERK1/2、MTA-3在肿瘤细胞迁移、侵袭中的作用机制尚不十分明确[7，8]。为探讨核转录因子-κB(NF-κB)、细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)、转移相关蛋白-3(MTA-3)在乳腺肿瘤中的作用及相关机制，本研究对60例乳腺肿瘤患者和30例同期乳腺增生患者的组织样本进行了检测分析，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取我院2017年8月至2019年3月收治的60例行切除手术的乳腺肿瘤(浸润性导管癌)患者作为观察组，年龄21～67岁。纳入标准：①经病理学检查确诊，且存在远处转移；②临床相关资料完整；③均为原发灶；④浸润性导管癌。排除标准：①合并其他恶性肿瘤者；②术前行放化疗和内分泌治疗或其他抗癌治疗者；③存在家族病史者。另取30例同期乳腺增生患者作为对照组，年龄25～62岁。纳入标准：均经病理学检查确诊为良性病灶。排除标准：①既往存在癌症史者。②均未采取放化疗及内分泌治疗。本研究经医院医学伦理委员会审核批准，所有患者均签署研究知情同意书。两组年龄、性别等基础资料比较差异无统计学意义，有可比性(P<0.05)。

1.2 方法将组织样本切片，脱蜡入水，使用微波辐射进行抗原修复，然后在3%过氧化氢去离子水中孵育10 min，再血清封闭15 min。加一抗于4 ℃孵育箱中过夜，然后再加二抗于37 ℃孵育箱中孵育30 min。滴加辣根酶标记链霉素卵白素工作液后再于37 ℃孵育箱中孵育15 min，以二胺基联苯胺染色5 min，然后以核固红进行轻度复染，用蒸馏水清洗干燥后以水溶性封片剂封片，于常温下保存。在光学显微镜下选择细胞数目较恒定区域，观察NF-κB、ERK1/2、MTA-3阳性细胞数并拍片。其中，NF-κB阳性表达为胞浆、胞核出现棕黄色颗粒(图1B)，ERK1/2阳性表达为胞浆、胞核出现黄色或棕黄色颗粒(图1C)，MTA-3阳性表达为胞核出现棕褐色颗粒(图1D)。免疫组化染色判断标准 “-”：无阳性表达；“+”：阳性细胞百分率为1%～30%；“++”：阳性细胞百分率为31%～70%；“+++”：阳性细胞百分率为71%～100%[11]。检测试剂为NF-κB和ERK1/2鼠抗人单克隆抗体(Neo Marker 公司)，以及MTA-3浓缩型兔抗人多克隆抗体(Abcam 公司)，检测按通用二步法试剂盒及二胺基联苯胺染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)及说明书操作。

图1 乳腺癌病理组织标本免疫组化检测结果 a：对照组；b：NF-κB阳性表达；c：ERK1/2阳性表达；d：MTA-3阳性表达 (SP法，×100)

1.3 统计学方法使用SPSS 22.0软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差表示，计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组阳性检出率比较观察组NF-κB、ERK1/2、阳性检出率高于对照组；MTA-3阳性检出率低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组阳性检出率比较 [n(%)]

2.2 不同临床特征的乳腺癌患者三种因子阳性率比较临床分期越高者、肿瘤直径越大者，NF-κB、ERK1/2阳性检出率越高，MTA-3阳性检出率低越低，差异有统计学意义(P<0.05)。LuminalA型、LuminalB型及HER2阳性分子分型患者NF-κB、ERK1/2阳性检出率高于三阴型，MTA-3阳性检出率低于三阴型，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同临床病理特征的乳腺癌组织中NF-κB、ERK1/2、MTA-3阳性检出率的关系 [n(%)]

2.3 乳腺增生患者与非淋巴结转移患者及淋巴结转移患者阳性检出率比较对照组NF-κB、ERK1/2、阳性检出率低于淋巴结转移患者及非淋巴结转移；MTA-3阳性检出率高于无转移患者及淋巴结转移患者，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 乳腺增生患者与非淋巴结转移患者及淋巴结转移患者阳性检出率比较 [n(%)]

3 讨论

恶性肿瘤的主要生物学特征之一是转移，能否降低临床肿瘤转移的漏诊率和误诊率对提高患者预后具有重要意义[9，10]。肿瘤细胞迁移受到多种细胞信号传导通路调控及多种蛋白和酶的控制，包括PI3K/Akt、MAPK和NF-κB等信号通路，MEK、ERK1/2或MEK/ERK1/2等细胞外信号调节激酶，以及MTA-1、MTA-2和MTA-3等转移相关蛋白[11，12]。目前对NF-κB、ERK1/2、MTA-3在乳腺肿瘤组织中的相关作用机制表达并不十分明确。

本研究结果显示乳腺癌患者组NF-κB阳性检出率高于乳腺增生组，存在淋巴结转移者中NF-κB阳性检出率也显著高于未发生转移者，且与转移部位没有显著相关。NF-κB对多种肿瘤细胞迁移相关基因或细胞因子的表达具有调节作用，包括基质金属蛋白酶和白介素-8等，其中，基质金属蛋白酶直接与乳腺肿瘤细胞的迁移扩散有关[13]。根据Penzo等[14]的研究，趋化因子CXCL12对细胞的定向诱导迁移作用和淋巴组织(淋巴结和淋巴管内皮细胞)的基础归巢作用均依赖于NF-κB信号传导通路。NF-κB是Rel家族中五种亚单位组成的二聚体，其存在的最常见形式为p50和p65组成的异二聚体，在静息状态下，IκBα与NF-κB/p65以非活性复合物的形式存在细胞质中，一旦NF-κB被激活，就会从细胞质向细胞核转移，从而对基因转录发挥调控作用[15]。也有研究表明[16]，蒽醌类衍生物可以降低IκBα的磷酸化和泛素化，从而抑制和阻断了NF-κB/p65信号通路。

本研究结果还显示在乳腺肿瘤组患者中ERK1/2阳性检出率(96.67%)显著高于乳腺增生组(3.33%)，这是因为MEK/ERK1/2细胞信号传导通路调节中，PDZK1为主要调控基因，其作用机制与NF-κB较为相似，有研究[17，18]通过全基因组关联分析发现PDZK1基因与乳腺肿瘤相关，并在ER阳性乳腺肿瘤患者的肿瘤组织中呈现高表达，参与了乳腺肿瘤发生、发展的多个信号通路调节，说明PDZK1调控乳腺癌的ERK1/2调节作用，与本研究结果一致。对于三阴型乳腺肿瘤而言，相较于其他分子分型的乳腺肿瘤，其漏诊率、误诊率更高，干预策略更少，预后更差。从本研究的分子分型相关性结果来看，三阴型和HER2阳性分型患者相较Luminal型存在显著高ERK1/2阳性检出率(P<0.05)，这可能与HERERK1/2信号通路与三阴型乳腺肿瘤细胞MDA-MB-231的表达有关，ERK1/2与MDA-MB-231细胞合成直接导致ERK1/2磷酸化进入细胞核，作用于多种转录因子，从而导致了肿瘤细胞增殖、迁移。侯俊杰等[20]研究证实，二甲双胍可以通过对MDA-MB-231细胞P-ERK1/2蛋白合成具有直接抑制作用，可以通过阻断MEK/IGF1/P-ERK/S6信号通路，来降低ERK1/2磷酸化表达水平来达到对三阴乳腺癌的抑制作用，说明ERK1/2在三阴乳腺癌分型的乳腺肿瘤的增殖和转移中具有一定的作用，从本研究的数据也得到了体现，ERK1/2在三阴型乳腺肿瘤组织中阳性检出率为100%，充分显示了ERK1/2信号通路在三阴型乳腺肿瘤微环境通信中的关键性作用，也对三阴乳腺癌的诊断和治疗干预提供一定的数据支持。本研究结果显示乳腺肿瘤组的MTA-3阳性检出率显著低于乳腺增生组，MTA-3在三阴乳腺癌分型呈现较低的阳性检出率(P<0.05)，也说明三阴乳腺癌分型的预后较其他三种分子分型更差。MTA-3是Mi-2核小体重组蛋白与脱乙酰酶蛋白复合体的重要组成部分，其虽然与MTA-1、MTA-2同源，但功能差异巨大[21]，MTA-3表达阳性则表示乳腺肿瘤患者预后良好的保护因素[22]。MTA-3在乳腺肿瘤患者中高表达，随有转移、肿瘤越大、临床分级越高而有增高的趋势。Si等[23]通过小鼠模型实验发现，MTA-3具有抑制乳腺肿瘤转移的作用。也有研究认为[24]，MTA-3与乳腺肿瘤分子分型生物学指标Ki-67呈负相关关系，而与参与恶性肿瘤转移的上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)表达呈正相关关系。本研究结果提示MTA-3参与乳腺肿瘤转移的机制可能是与下调Ki-67表达水平、上调E-cadherin表达水平有关。进一步探讨乳腺癌的MTA-3表达水平的变化和调节机制有助于深入了解乳腺癌和三阴乳腺癌分型的疾病机制。

综上，在乳腺肿瘤组织中存在NF-κB和ERK1/2的高阳性表达和MTA-3和低表达，NF-κB广泛参与调控多种基因转录和调节乳腺肿瘤的发生、发展，ERK1/2在乳腺肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭过程中扮演调节信号传导通路的作用，MTA-3与乳腺肿瘤患者淋巴结转移密切相关，因此在临床实践中结合三者指标分析可以提高乳腺肿瘤患者的诊断和干预率，改善乳腺肿瘤患者的预后。