玉米籽粒缺陷突变基因dek54的精细定位及候选基因分析

周 练 刘朝显 陈秋栏 王文琴 姚 顺 赵子堃 朱思颖 洪祥德 熊雨涵 蔡一林

玉米籽粒缺陷突变基因的精细定位及候选基因分析

周 练 刘朝显 陈秋栏 王文琴 姚 顺 赵子堃 朱思颖 洪祥德 熊雨涵 蔡一林*

西南大学玉米研究所 / 农业科学研究院 / 南方山地作物逆境生物学国家级培育基地, 重庆 400715

玉米籽粒与产量和营养品质密切相关, 控制籽粒发育基因的功能研究对解析籽粒发育分子机制, 提高玉米产量, 改善籽粒营养品质提供重要依据。利用甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate, EMS)处理B73花粉, 筛选到一个玉米籽粒缺陷突变体()。表现出成熟籽粒变小、皱缩、颜色发白等特征; 遗传分析表明是一个单基因控制的隐性突变体。石蜡切片显示淀粉胚乳细胞形状不规则且排列致密, 扫描电镜观察成熟籽粒胚乳中心区域发现淀粉粒周围蛋白体比野生型少且排列疏松。成熟籽粒的总蛋白、醇溶蛋白、各氨基酸组分和全氮含量相比野生型都显著降低。利用F2分离群体中的1566个单株, 把定位在7号染色体标记SSR6和SSR7之间, 物理位置约为290 kb。该区间有3个基因, 基因测序发现基因第2个外显子上第351个碱基由G突变为A, 从而导致蛋白翻译的提前终止。该基因在玉米籽粒中特异性表达, 且在12 DAP (days after pollination)籽粒中表达量最高。通过CRISPR/Cas9系统进行靶向突变确定候选基因导致该突变表型。编码一个与ZmNRT1.5 (nitrate transporter)具有较高同源性的MFS (major facilitator superfamily)家族蛋白并定位在玉米原生质体的细胞质膜。该研究为揭示在玉米籽粒发育的分子机制奠定了重要基础。

玉米;; 籽粒发育; 精细定位

玉米(L.)作为一年生禾本科植物, 是我国重要的粮食作物。玉米生产对保障我国粮食安全有着重要的战略意义。随着世界人口和经济水平的不断增长, 对玉米产量和营养品质的要求日益增长。玉米的胚和胚乳作为籽粒的主要组成部分, 来自植物双受精作用, 与玉米产量和营养品质密切相关。玉米籽粒主要是由淀粉、蛋白质和油脂组成。其中淀粉和蛋白质主要储存在胚乳中, 油脂主要存在胚中。玉米胚乳由4种不同类型的细胞组成, 包括淀粉胚乳细胞、基部胚乳转移层细胞、糊粉层细胞和胚包围层细胞[1-2]。8~14 DAP胚乳细胞具有很强的有丝分裂活性, 到20~25 DAP时有丝分裂细胞只在包含糊粉层和亚糊粉层的外周细胞层增殖。淀粉胚乳细胞在胚乳的中央区域, 10 DAP淀粉胚乳细胞从有丝分裂转变为核内复制[1]。淀粉胚乳细胞储存籽粒中大部分的淀粉和蛋白质, 有效地决定籽粒质地和营养品质。玉米籽粒胚乳的外侧是蛋白体含量较多的透明区域, 而中心则是由较多淀粉粒和少量蛋白体组成的不透明区域。淀粉粒和蛋白体之间的比例决定着玉米籽粒的硬度, 也是玉米品质的重要影响因素。玉米胚乳蛋白的质量也会影响玉米营养品质和病虫害抗性。胚乳蛋白中醇溶蛋白(zein)的含量占籽粒总蛋白量的70%左右, 但醇溶蛋白中人体必需的赖氨酸含量低, 极大的降低了玉米的营养价值。因此, 醇溶蛋白和非醇溶蛋白的比例也是决定玉米籽粒品质的重要因素之一。

随着玉米全基因组测序的完成, 玉米籽粒发育及产量相关的基因功能研究逐渐成为热点。玉米具有大量的籽粒突变体, 这些突变体籽粒表型表现异常。根据遗传学分析, 可以分为3种不同的类型, 包括: (1) 单基因隐性突变体:突变体[3-6]、[7]、[8]、[9]、[10]、[11]和[12]等,突变体影响籽粒胚和胚乳的发育, 使籽粒产生严重缺陷。例如突变体产生小粒的胚致死表型,基因编码一种线粒体核糖体蛋白L9, 调节细胞生长和籽粒发育[12]。突变体[13]、[14-15]、[16]、[17]、[18]和[19]等,突变体籽粒粉质化, 通过改变醇溶蛋白含量从而影响胚乳质地和蛋白品质。例如突变体基因编码蛋白影响19-kD和22-kD α-zein以及16-kD γ-zein的合成, 从而引起蛋白体数量减少和变小, 出现粉质胚乳表型[17]。(2) 显性突变体(Mc)[20]和(De-B30)[21], DeB30突变体籽粒的非醇溶蛋白比正常籽粒增加了约70%。(3) 半显性突变体[22]和[23],突变体也会引起胚乳粉质化。例如由于单个氨基酸的突变使得22 kD α-zein的信号肽不能正常剪切从而导致蛋白体异常[23]。由于玉米基因组大, 且转座子元件较多, 相比水稻等主要粮食作物, 仍有大量籽粒突变基因的功能及分子机制仍然不清楚。

本研究利用EMS处理玉米自交系B73花粉得到一个籽粒缺陷突变体(根据已发表的突变体顺序命名)。本研究观察了籽粒形态学和组织学结构, 分析了籽粒相关生化成分; 通过与Mo17构建的F2分离群体对进行了基因定位, 并通过CRISPR/Cas9系统靶向突变确定了候选基因; 分析了基因在不同组织的时空表达情况及其编码蛋白结构和同源性比对, 明确了Dek54蛋白的细胞质膜定位结果。该研究解析在玉米籽粒发育中的分子机制奠定了重要基础。

1 材料与方法

1.1 dek54突变体获得和分离群体构建

2015年春, 于重庆北碚田间种植玉米自交系B73和Mo17, 收集B73花粉进行EMS (终浓度0.67 mL L–1)诱变处理; 将诱变处理后的花粉与Mo17植株进行杂交。同年下半年, 把获得的M0代籽粒种植于云南元江, 自交后收获果穗, 观察表型, 筛选出了籽粒皱缩突变体。继续用为母本与Mo17杂交, 构建F2分离群体。提取1566个植株DNA, 鉴定其基因型, 筛选重组单株, 对进行精细定位。

1.2 石蜡切片和扫描电镜观察

分别取16 DAP果穗上的野生型和未成熟籽粒, 在福尔马林-乙酸-乙醇固定液(FAA, 50%乙醇, 0.9 mmol L–1冰醋酸, 3.7%甲醛)中4℃固定过夜。将样品放置在一系列乙醇和二甲苯梯度溶液中脱水, 在石蜡中进行包埋。将石蜡样本切成10 μm的厚度,经烤片并脱水后, 用1%番红和固绿(Amresco)染色。荧光显微镜下(Leica, D3000)进行观察。分别取F2果穗上野生型和的成熟籽粒, 经临界干燥、断面喷金后, 在扫描电镜下(Hitachi, SU3500)观察与野生型的籽粒相同部位胚乳形态结构差异。

1.3 籽粒蛋白、淀粉、氨基酸和全氮含量测定

分别取F2群体中同一个果穗上野生型和的成熟籽粒, 用水浸泡5 min, 并去除种皮和胚。将剩余胚乳部分在液氮中研磨成细粉。将真空抽干粉末各称取50 mg两份, 加入1 mL石油醚, 置于37℃摇床1 h; 去除石油醚, 加入硼酸钠蛋白提取液和巯基乙醇, 37℃摇床过夜。分别提取每个样品的总蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白, 并进行蛋白含量测定[17]。总淀粉含量的测量按照总淀粉测定试剂盒(Megazyme, K-TSTA-100A)使用说明进行。将样品进行蛋白质水解, 去除脂质、色素等, 使用全自动氨基酸分析仪(Hitachi, L-8900)测定氨基酸含量, 每个样品3次重复。将样品用浓硫酸/双氧水进行消煮, 使用凯氏定氮仪(Alva, KN580)测定全氮含量。

1.4 dek54连锁标记筛选及精细定位

在F2群体中分别选择10株野生型和10株突变体, 提取基因组DNA, 并等量混合, 构建突变体DNA池(mutant DNA pool, MP)和野生型DNA池(wild-type DNA pool, WP)。利用实验室已有的覆盖玉米全基因组, 在B73和Mo17之间有多态性的432个SSR标记对这2个DNA进行扩增。筛选在2个DNA池之间具有多态性的分子标记。通过Gramene网站(http://www.gramene.org/)下载玉米基因组DNA序列, 并通过SSRHunter[24]开发SSR标记; 验证在B73和Mo17之间具有多态性后用于的精细定位。

1.5 qRT-PCR

取B73根、茎、叶、未成熟雌穗(1~2 cm)和雄穗(1~2 cm)及12、14、16、18、20 DAP的未成熟籽粒和成熟籽粒, 迅速冻于液氮。提取总RNA, 进行反转录生成cDNA[25]。qRT-PCR (quantitative reverse transcription- PCR)中利用玉米基因作为内参, 样品间同一基因的相对表达量通过下例公式计算: 2-DDCt。

1.6 载体构建及玉米遗传转化

通过对候选基因gDNA序列进行分析, 选择第2个外显子的19 bp (5'-GCCGAG CTACCTCTGCGAC-3')的靶向序列。合成包括靶向序列和sgRNA在内的寡核苷酸引物, 采用单编辑策略将该序列克隆到pCAMBIA3301-Cas9载体, 并将构建好的载体转入农杆菌EHA105菌株。通过农杆菌介导的玉米未成熟胚遗传转化, 获得玉米转基因植株。通过测序来确定CRISPR/Cas9编辑玉米植株目标位置附近的编辑位点, 获得5个独立的CRISPR/ Cas9基因敲除转基因株系, 选择2个转基因株系进行后续实验。

1.7 基因注释及系统进化分析

通过NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和MaizeGDB (https://maizegdb.org/)等数据库网站, 搜索下载相关基因的基因组、cDNA和蛋白序列。通过BLAST CD-Search (basic local alignment search toolconserved domain search, https://www.ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)比对分析目标蛋白的保守序列。将所有进行比对的氨基酸序列转换成FASTA格式合并导出, 通过CLUSTALW进行多序列比分析, 在使用MEGA6进行N-J (neighbor-joining)进化树构建。

1.8 亚细胞定位

以玉米B73的12 DAP未成熟籽粒cDNA为模板, 通过PCR扩增的全长CDS序列(除去终止密码子)连接到pAN580载体, 构建Dek54-GFP融合表达载体。将含有正确插入片段的载体和质膜定位标记载体PM107 (AtPIP1; 2-mCherry)分别通过PEG介导共转化玉米原生质体。在激光共聚焦显微镜(LSM800, Carl Zeiss)下观察荧光。

2 结果与分析

2.1 dek54表型鉴定与遗传分析

利用EMS化学诱变技术获得了玉米籽粒缺陷突变体。该突变体与Mo17杂交, F1群体表型表现正常, 自交后F2果穗上产生分离(图1-A)。统计5个F2果穗, 野生型(+/+和/+)与突变型(/)籽粒分别有1549粒和499粒, 适合度测验结果显示, 野生型和突变体籽粒的分离比接近3∶1 (χ2= 0.16 < χ20.05= 3.84), 说明是一个单基因控制的隐性突变体。

与野生型相比表现为, 成熟籽粒变小, 皱缩干瘪, 且颜色发白(图1-A, B)。对野生型和成熟籽粒进行徒手切片并在体式显微镜下观察籽粒胚和胚乳的形态。籽粒纵切面显示, 突变体胚的形状正常, 但显著小于野生型(图1-C), 突变体籽粒较野生型萌发延迟但后续生长正常(附图1)。籽粒横切面显示, 突变体籽粒胚乳中间不透明的淀粉胚乳面积缩小, 分布在粉质胚乳周围的透明玻璃质胚乳面积显著增大(图1-D)。野生型和的百粒重分别为31.2 g和10.0 g,仅为野生型的32.0%;十粒长和十粒宽分别为野生型的79.0%和66.7%, 均显著低于野生型(图1-E)。由此可见,突变显著影响了籽粒胚和胚乳的发育。

2.2 dek54籽粒组织学观察

取16 DAP的野生型和突变体籽粒进行石蜡切片观察。结果显示,的种皮与胚乳脱离, 胚乳细胞相比野生型发生了明显变化, 表现在糊粉层细胞相比野生型层数增加, 并且淀粉胚乳细胞组织形态不规则并且相比野生型排列较密且较小(图2-A)。说明突变显著地影响胚乳细胞的发育。推测由于胚乳细胞发育的不完全使得突变体籽粒表现出皱缩的表型。对成熟籽粒横截面的扫描电镜观察显示, 相同位置的野生型胚乳中淀粉粒周围有密集的蛋白体包围, 而突变体的淀粉周围蛋白体数量较少, 且排列较疏松(图2-B)。

A: 成熟果穗F2分离群体; B: 籽粒表型; C: 籽粒纵切; D: 籽粒横切; E: F2分离群体上野生型和突变体籽粒的百粒重、十粒长和十粒宽。标尺为0.5 cm。Em: 胚; En: 胚乳; SE: 粉质胚乳; VE: 玻璃质胚乳。

A: F2segregating population of mature ear; B: phenotypes of kernels; C: cross section of kernels; D: longitudinally section of kernels; E: 100-kernel weight, ten-kernel length, and ten-kernel width of WT andmutant kernels from F2segregating population. Bar: 0.5 cm. Em: embryo; En: endosperm; SE: starchy endosperm; VE: vitreous endosperm.

A: 16 DAP野生型和突变体籽粒的石蜡切片纵切观察。标尺为100 µm。AL: 糊粉层; SE: 淀粉胚乳。B: 野生型和突变体成熟籽粒胚乳中心区域扫描电镜观察。标尺为50 µm。SG: 淀粉粒; PB: 蛋白体。

A: longitudinal paraffin sections observation of developing WT andmutant kernels at 16 DAP. Bar: 100 µm. AL: aleurone layer; SG: starch endosperm. B: scanning electron microscopy observation of the central regions of WT andmutant mature kernel endosperm. Bar: 50 µm. SG: starch granule; PB: protein body.

2.3 dek54相关生化成分检测

分别提取野生型和成熟籽粒胚乳中的总蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白。结果显示, 突变体的总蛋白和醇溶蛋白含量相比野生型分别降低了29.2%和27.6%, 而非醇溶蛋白没有显著差异(图3-A)。成熟籽粒胚乳中的淀粉含量测定发现, 突变体的胚乳淀粉含量与野生型没有显著差异(图3-B)。总氨基酸含量测定显示, 突变体籽粒胚乳中各类氨基酸含量相比野生型均显著降低, 其中赖氨酸含量仅为野生型的63.0% (图3-C)。进一步全氮含量测定结果表明,突变体的成熟籽粒中全氮含量显著低于野生型, 降低了16.5% (图3-D)。

2.4 dek54突变体的精细定位

利用432个在B73和Mo17基因组间有多态性的SSR标记对突变体DNA池和野生型DNA池进行筛选。发现SSR标记umc2160在2个DNA池中检测出多态性(图4-A), 该标记位于第7号染色体的7.01 bin。使用umc2160检测33株的基因型, 结果显示30株的基因型与表型相一致, 3株(17、25和27)因为染色体重组表现为杂合基因型(图4-B), 由此证实了该标记与基因连锁。在umc2160标记邻近的区间开发新的SSR标记(表1)用于定位。利用F2群体中1566个单株将初步定位在与SSR标记SSR23403和SSR0308相邻的8.52 Mb的物理区间内(图4-C)。进一步通过重组植株的筛选, 开发并筛选到8个具有多态性的SSR标记。在SSR1~8标记位置各筛选到交换单株20、11、11、3、2、2、2和11株。最终,定位在玉米7号染色体标记SSR6和SSR7之间物理距离约为290 kb的区间内(图4-C)。

野生型和突变体成熟籽粒的蛋白(A)、淀粉(B)、各氨基酸组分(C)和全氮含量(D)。

Protein (A), starch (B), amino acid components (C), and total nitrogen contents (D) of WT andmutant kernels.

A: umc2160的PCR扩增产物在WP和MP之间具有多态性; B: 通过33个单株的基因分型确定SSR连锁标记umc2160; C: 通过F2群体1566个单株对进行精细定位。定位标记SSR6和SSR7之间物理距离约为290 kb的区间内。黑色垂直实线上方为分子标记名称, 下方数字为该标记鉴定的交换单株数量。

A: the polymorphic PCR products amplified by umc2160 between WP and MP; B: confirmation of linkage SSR marker umc2160 by genotyping 33mutant plants; C: fine mapping ofusing F2population including 1566 individuals.was mapped to an interval about 290 kb flanked by SSR6 and SSR7. The symbols above and below the black vertical solid lines represent the molecular marker and the number of recombinants, respectively.

表1 dek54定位SSR标记引物序列

表2 dek54定位区间基因注释

2.5 候选基因序列及表达分析

Gramene玉米数据库显示SSR6和SSR7之间物理距离约为290 kb, 定位区间内仅包括3个基因(表2), 通过扩增并测序, 比较这3个基因在与对照B73的DNA序列, 发现基因第2个外显子上第351个碱基位点由G突变转换为A, 导致密码子由TGG变为TAG, 从而造成蛋白翻译的提前终止(图5-A); 而其他2个基因的DNA序列没有差异。因此推测基因的突变是导致表型产生的原因。

通过qRT-PCR的方法, 检测基因在玉米自交系B73的不同组织的表达情况, 包括根、茎、叶、雄穗、花丝、12、14、16、18、20 DAP的未成熟籽粒和成熟籽粒。检测表明,基因在未成熟籽粒(12~20 DAP)中特异性表达; 且在12 DAP未成熟籽粒中表达量最高, 并随着籽粒发育表达量逐渐下降, 在其他组织和成熟籽粒中均不能检测到其表达(图5-B)。基因在未成熟籽粒中的特异性表达说明其在籽粒发育过程中发挥作用。

2.6 CRISPR/Cas9靶向突变Zm00001d019294基因表型鉴定

利用CRISPR/Cas9系统对基因进行靶向突变。以的第2个外显子为靶标设计sgRNA间隔序列。获得了5个独立的CRISPR/Cas9转基因株系, 通过测序确定其中2个(和)含有由目标序列插入或缺失引起的密码子移位突变(图6-A)。CRISPR/Cas9转基因株系的成熟籽粒与表现出相似的缺陷表型(图6-B~D)。该结果表明基因是引起该籽粒突变表型的目标基因。

A:基因结构图, 红色箭头所示为突变位点; B:基因在不同组织及发育中的未成熟籽粒中的表达分析。

A: gene structure diagram of. The red arrow indicates mutation sites. B: the relative expression level ofin different tissues and developing immature kernel.

A:的CRISPR/Cas9靶位点序列。sgRNA靶序列为绿色, PAM (protospacer-adjacent motif)序列为橙色, 红色字母和短线分别代表插入和缺失; B:xMo17的F2成熟果穗; C: 成熟的WT和籽粒; D: 成熟的WT和籽粒的纵切。Em: 胚; En: 胚乳。标尺为0.5 cm。

A: the sequence in thelocus targeted using CRISPR/Cas9. The sgRNA target sequence is green. Protospacer-adjacent motif (PAM) is blue. Red letters and dashes represent insertions and deletions, respectively. B: mature F2ear ofxMo17. C: mature WT andkernels. D: longitudinal paraffin sections of mature WT andkernels. Em: embryo; En: endosperm. Bars: 0.5 cm.

2.7 Dek54蛋白预测及亚细胞定位

()由5个外显子和4个内含子组成。的成熟转录本编码序列长1923 bp, 编码一个由640个氨基酸组成的蛋白。通过BLAST CD-Search比对分析该蛋白的保守序列, 结果表明, Dek54蛋白序列中包含MFS保守结构域(图7-A)。蛋白序列比对及系统进化分析发现, Dek54蛋白与玉米和拟南芥硝酸盐转运体NRT1类蛋白具有较高的同源性, 且与ZmNRT1.5B和ZmNRT1.5A蛋白序列同源性最高(图7-B)。通过PEG介导的玉米原生质体共转化及荧光显微镜观察显示, Dek54蛋白的绿色荧光与质膜标记蛋白红色荧光完全重合(图8), 表明Dek54定位在细胞质膜上。推测Dek54可能是一个位于细胞质膜的硝酸盐转运体。

Dek54-GFP载体与mCherry标记的质膜标记(mCherry-PM; CD3-1007)共定位。标尺为20 μm。

Dek54-GFP was co-localized with a mCherry-labeled plasma membrane marker (mCherry-PM; CD3-1007). Bar: 20 μm.

3 讨论

籽粒缺陷(,)突变体是一类主要的玉米籽粒突变体。突变体表型变化极为显著, 主要表现为, 胚乳发育缺陷、籽粒较小、种皮与胚乳分离、种皮颜色较浅, 且表面皱缩等特征[26]。本研究中,突变体具有突变体的典型表型特征, 其胚发育延迟, 胚乳发育不良; 相比野生型,籽粒的长、宽和粒重都显著降低。是一个单基因控制的隐性突变体, 显示为功能缺失突变。对玉米籽粒缺陷突变体进行精细定位, 并通过CRISPR/Cas9系统靶向突变实验确定导致突变表型的基因。测序结果显示,突变体在基因的第2个外显子上有一个碱基突变导致该密码子突变为终止子, 提前终止了蛋白序列。qRT-PCR结果表明,基因在未成熟籽粒中特异性表达, 并随着籽粒的发育表达降低, 且在成熟籽粒中不表达。说明基因在玉米籽粒发育过程中起着重要作用。

玉米中突变体种类多, 涉及的机制非常复杂。至今, 超过20个突变体已被鉴定。大部分突变体都是由PPR (pentatricopeptide repeat)蛋白突变所引起[7,9-11,27-29]。PPR蛋白在线粒体和质体中特异性作用于RNA编辑、剪辑、稳定性和转录后调控等重要进程[30], 但也有部分突变体不是PPR蛋白突变引起。例如Dek1编码一个钙蛋白酶家族蛋白, 影响籽粒胚和胚乳的糊粉层发育[3], 可能在陆地植物表面细胞位置传感和信号传递过程中发挥重要作用[31]; Dek15编码一个黏连蛋白装载复合体亚基, 决定染色体分离和籽粒发育[8]。本研究中,基因编码一个含有MFS保守结构域的蛋白。MFS是一类广泛存在细胞膜上的转运蛋白家族, 由协同转运体、共转运体和反向转运体共同组成, 能够转运多种底物包括无机和有机离子、核酸、氨基酸、短肽和脂类物质[32], 在多种生理生化途径中起着重要作用。所有的MFS转运体都具有一个典型的MFS折叠。这个折叠包含了2个结构域, 每个结构域都由6个连续的跨膜基序组成, 分别称为N端和C端结构域[33]。Dek1蛋白由一个多跨膜结构域(mutispanning tranmembrane domain, MEM)组成[3]。序列分析发现, MFS和DEK1-MEM的第16到22个跨膜基序具有相似性, 推测MFS蛋白在响应化学渗透梯度促进各种溶质跨膜运输的功能, 与MEM感知相邻细胞表面膜和外部环境差异方面功能的作用是相容的[4]。硝酸盐转运体NRT1是在高等植物中唯一具有典型的MFS结构的蛋白[34]。由于对氨基酸残基T101的磷酸化[35], 使得NRT1蛋白对硝酸根离子NO3-具有双亲和力, 即高亲和力和低亲和力[36]。其中, AtNRT1.5介导NO3-的外排, 并在将NO3-装载进入木质部, 并转运到地上部分起着重要作用[37]。AtNRT1.8负责从根和木质部中提取NO3-, 并与AtNRT1.5协同调控NO3-的远距离运输[38]。将拟南芥和玉米的NRT1家族的蛋白以及Dek54蛋白进行比对及系统分析, Dek54与ZmNRT1.5B、ZmNRT1.5A、AtNRT1.5和AtNRT1.8分在一个组, 且具有最大的序列相似性。进一步研究表明, Dek54蛋白定位在玉米原生质体的细胞质膜上。组织学观察显示,突变体籽粒淀粉胚乳细胞组织形态不规则, 并且相比野生型排列较密且较小, 胚乳中心区域的淀粉粒周围的蛋白体相比野生型较小, 且数量较少。突变成熟体籽粒的总蛋白、醇溶蛋白、各类氨基酸及全氮含量均显著低于野生型。推测突变体可能由于硝酸盐转运体的缺失, 导致在玉米籽粒发育过程中不能有效的转运氮, 从而造成胚乳和胚的发育缺陷。但Dek54如何在玉米籽粒发育中发挥功能的具体作用机制仍然不明确。我们发现新的籽粒突变体丰富了玉米籽粒发育的研究材料, 为进一步解析该基因在玉米籽粒发育过程的分子机制奠定了基础。

4 结论

通过EMS化学诱变, 鉴定了一个新的玉米籽粒缺陷突变体。被定位在玉米7号染色体标记SSR6和SSR7之间物理距离约为290 kb的区间内。测序发现基因的第2个外显子上第351个碱基由G突变转换为A, 从而引起蛋白翻译的提前终止, 并在玉米未成熟籽粒中特异性表达。CRISPR/Cas9系统靶向突变实验确定与突变表型相关的候选基因, 该基因编码一个MFS家族蛋白并与ZmNRT1.5具有较高的同源性。此外, Dek54蛋白定位在玉米原生质体的细胞质膜上。突变体为解析玉米籽粒发育的分子机制提供了新的研究材料和理论依据。

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附图1 野生型和成熟籽粒的发芽测试(发芽后5 d)

Fig. S1 Germination test of wildtype andmature kernels (5 days after germination)

标尺为1 cm。Bar: 1 cm.

Fine mapping and candidate gene analysis of maize defective kernel mutant

ZHOU Lian, LIU Chao-xian, CHEN Qiu-Lan, WANG Wen-Qin, YAO Shun, ZHAO Zi-Kun, ZHU Si-Ying, HONG Xiang-de, XIONG Yu-han, and CAI Yi-lin*

1Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100087, China;2Beijing Engineering and Technique Research Center for Hybrid Wheat, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Municipal Key Laboratory of the Molecular Genetics of Hybrid Wheat, Beijing 100097, China

Maize kernel is closely related to yield and nutritive quality. Study on the function of maize kernel development relative genes provides important basis for the molecular mechanism analysis, yield increasing and nutritive quality improving. B73 pollen was treated with ethyl methylmethanesulfonate (EMS) and a defective maize kernel() was screened.had small mature kernel, wrinkled and whitened seed coat phenotype. Genetic analysis indicated thatis a recessive mutant controlled by a single gene. Paraffin sections showed starchy endosperm cells ofhad irregular shape and dense arrangement at developmental stage. Scanning electron microscopy observation indicated that protein bodies around starch granules in the central region of themature kernel endosperm were fewer and arranged more loosely compare to wild type. Total protein, zein, amino acids components contents and total nitrogen content ofmature kernel were significantly lowered compared with the wild type.was located on chromosome 7 within the interval of the physical distance of about 290 kb between markers SSR6 and SSR7. Sequencing revealed that the 351th base G on the 2nd exon ofgene changed into A, which led to the premature termination of the protein translation.gene was specifically expressed in immature maize kernel, and has the highest expression in 12 DAP (days after pollination) immature kernel. Targeted mutation was performed using CRISPR/Cas9 system to identify that mutantphenotype was caused by candidate gene.encoded an MFS (major facilitator superfamily) protein and had high homology with ZmNRT1.5 (nitrate transporter). Besides, Dek54 protein was localized in the plasma membrane of maize protoplasts. The study oflaid the foundation for the molecular mechanism analysis of maize kernel development.

maize (L.);; kernel development; fine mapping

10.3724/SP.J.1006.2021.03060

本研究由国家自然科学基金项目(31601312)资助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31601312).

蔡一林, E-mail: caiyilin1789@163.com

E-mail:zhoulianjojo@swu.edu.cn

2020-10-15;

2021-01-13;

2021-03-02.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210301.1612.013.html