慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者血清对PM2.5所致MH-S细胞炎症的影响及salubrinal的作用*

王 正， 郝赫莉， 王晓彤， 武思羽， 阎锡新， 张霄鹏， 孟爱宏△

（1河北医科大学第二医院北院区呼吸与危重症医学科，河北石家庄050004；2河北医科大学第二医院呼吸与危重症医学一科，河北石家庄050000；3河北省人民医院胸外二科，河北石家庄050051）

感染所致炎症是慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者病情急性加重住院的主要原因。细颗粒物（particulate matter 2.5，PM2.5）是指大气中直径≤2.5 μm 的颗粒物与COPD 存在密切关联，但致病机制尚不完全清楚。PM2.5 刺激可诱发与炎症有密切关系的内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）。C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）是ERS 中的关键分子，研究证实CHOP 活化还具有促炎作用。磷酸酶抑制剂salubrinal 可通过抑制PERK-eIF2α 通路中eIF2α 的去磷酸化，加速堆积的未折叠蛋白的分解，缓解ERS，减少细胞CHOP 的表达，但salubrinal能否通过缓解ERS而影响PM2.5导致的炎症尚不清楚。本研究将COPD 急性加重期（acute exacerbation of COPD，AECOPD）患者或健康志愿者血清与PM2.5 共同刺激小鼠肺泡巨噬细胞株MH-S，检测MH-S 细胞组蛋白脱乙酰酶2（histone deacetylase 2，HDAC2）活性及炎症因子白细胞介素17（interleukin-17，IL-17）的分泌，模拟AECOPD 炎症状态下PM2.5对MH-S细胞的影响，进一步以salubrinal干预PM2.5处理的 MH-S 细胞，探讨 salubrinal 在 PM2.5 所 致MH-S细胞损伤中的作用。

材料和方法

1 实验材料

1.1 实验仪器 Mk3 全自动酶标仪（芬兰雷博）；共聚焦显微镜（Zeiss）；北京四环科学仪器厂TLL-C 台式高速冷冻离心机（北京四环科学仪器厂）。

1.2 主要材料与试剂 永生化小鼠肺泡巨噬细胞株MH-S 购自ATCC。IL-17 ELISA 试剂盒购自北京四正柏生物科技有限公司；HDAC2 活性比色法定量检测试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司；细胞活力及毒性检测试剂盒（CCK-8）购自东仁化学科技（上海）有限公司；健康志愿者血清取自健康志愿者；AECOPD 患者血清取自河北医大二院呼吸三科就诊患者；PM2.5 由河北医科大学第二医院呼吸一科赠送；salubrinal 购自 APExBIO；兔抗 GRP78 和CHOP 抗体及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 购自武汉三鹰生物技术有限公司。本研究已获得河北医科大学第二医院伦理委员会审批。

2 实验方法

2.1 颗粒物悬液的制备 称取60 mg PM2.5，加入6 mL RPMI-1640 培养液，配制成浓度为10 g/L 的颗粒物悬液，高压蒸汽灭菌10 min，用前超声震荡2 min，用培养基稀释成1 g/L 待用。前期行预实验确定 PM2.5 刺激的适宜浓度和时间：25、75、100 和200 mg/L 的 PM2.5 刺激 MH-S 细胞 6 h，细胞存活率分别为97.0%、92.3%、90.0%和74.5%；刺激细胞12 h，细胞存活率分别为96.8%、89.6%、87.1%和76.8%；刺激细胞24 h，细胞存活率分别为：92.7%、82.8%、76.0%和66.9%。据此选择染毒剂量的PM2.5 浓度为100 mg/L，时间为12 h。

2.2 细胞分组及培养 用CCK-8 实验检测不同浓度AECOPD 患者和健康志愿者血清刺激后MH-S 细胞的活力，并选取存活率大于80%的血清浓度和作用时间。经活性测定后确定实验所需血清浓度为1%、作用时间为6 h。

检测AECOPD 血清对PM2.5 致MH-S 细胞炎症的影响：分为对照组、PM2.5 组、健康志愿者血清组、AECOPD 患者血清组、PM2.5+健康志愿者血清组和PM2.5+AECOPD 患者血清组。PM2.5 终浓度为100 mg/L，刺激 6 h。为探讨 salubrinal 在 PM2.5 致 MH-S细胞损伤中的作用，前期实验证实PM2.5 作用12 h对巨噬细胞有明显促炎作用，将细胞分为对照组、PM2.5 组和salubrinal+PM2.5 组，培养液中加入salubrina（lsalubrinal提前1 h加入30 μmoL）和PM2.5（终浓度100 mg/L），刺激12 h。

2.3 IL-17 和HDAC2 的检测及细胞免疫荧光实验 按上述分组取细胞上清液，利用IL-17 检测试剂盒（酶联免疫吸附试验法）检测IL-17 浓度。细胞按HDAC2 试剂盒说明书提取蛋白，测定蛋白浓度，检测HDAC2 活性（比色法）。取细胞爬片根据细胞免疫荧光实验步骤处理，加入荧光抗衰减剂，存于-20 ℃冰箱，封片1周内共聚焦显微镜下观察。

3 统计学处理

应用SPSS 21.0 软件对实验数据进行统计学分析。数据正态分布结果以均数±标准差（mean±SD）表示。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）多组比较，各组之间进一步用SNK-q检验进行两两比较分析。相关分析采用Pearson相关分析法，以P＜0.05作为差异有统计学意义判断的标准。

结 果

1 CCK-8法测定血清刺激的MH-S细胞活力

采用1%健康志愿者血清、1% AECOPD 患者血清和5%健康志愿者血清和5%AECOPD 患者血清刺激MH-S 细胞6 h，细胞相对活力分别为（89.68±11.29）% 、（89.43±6.49）% 、（41.47±13.28）% 和（39.62±13.54）%。1%健康志愿者血清和1% AECOPD患者血清刺激MH-S细胞12 h细胞相对活力分别为（41.92±6.59）%和（42.69±10.24）%。选取细胞相对活力在80%进行实验，由此选取1%的血清刺激MH-S 细胞6 h。1%健康志愿者血清和1%AECOPD 患者血清刺激MH-S 细胞6 h 细胞存活率的差异无统计学显著性。

2 AECOPD 血清对 PM2.5 所致 MH-S 细胞炎症的影响

由表1 可见，与对照组相比，PM2.5 刺激MH-S细胞致细胞上清液IL-17 含量增加，细胞HDAC2 活性降低（P＜0.05）；分别加入AECOPD 患者血清和健康志愿者血清，上清液中IL-17 含量增多，细胞HDAC2 活性降低（P＜0.05），且AECOPD 患者血清组较健康志愿者血清组上述变化更明显（P＜0.05）；同时加入血清和PM2.5组较单纯加入PM2.5组及单纯加入血清组MH-S 细胞炎症因子升高，细胞HDAC2活性降低更明显（P＜0.05）。PM2.5+AECOPD 患者血清组较PM2.5+健康志愿者血清组炎症因子IL-17升高明显，HDAC2 活性降低明显（P＜0.05）。IL-17与HDAC2之间存在负相关（r=-0.786，P＜0.01）。

表1 血清与PM2.5对MH-S细胞分泌IL-17及HDAC2活性的影响Table 1.Effects of serum and PM2.5 on IL-17 content and HDAC2 activity in MH-S cells（Mean±SD. n=20）

3 salubrinal在PM2.5致MH-S细胞损伤中的作用

3.1 免疫荧光结果 由图1、2 可见，PM2.5 组细胞CHOP 荧光较对照组明显增强，以核内明显；加入salubrinal 干预后CHOP 荧光较PM2.5 组减弱。PM2.5组GRP78 荧光较对照组增强，以胞质内居多，加入salubrinal干预后GRP78荧光较PM2.5组增强。

Figure 1.Comparison of CHOP fluorescence staining in different groups.Red arrows indicated the enhanced fluorescence of CHOP，especially in the nucleus.图1 不同分组CHOP荧光染色图的比较

Figure 2.The images of GRP78 fluorescence staining in different groups.Red arrows indicated the enhanced fluorescence of GRP78，especially in the cytoplasm.图2 不同分组GRP78荧光染色图片的比较

3.2 ELISA 法检测细胞上清液中IL-17 浓度的变化及细胞中HDAC2 活性的变化 由表2 可见，与对照组相比，PM2.5 刺激致MH-S 细胞上清液IL-17 含量增加（P＜0.05）；用 salubrinal 干预后，IL-17 含量较PM2.5 刺激组减少，但仍高于对照组，且差异有统计学意义（P＜0.05）。与对照组相比，PM2.5 刺激致细胞 HDAC2 活性降低（P＜0.05）；用salubrinal 干预后HDAC2活性有所恢复，但仍低于对照组（P＜0.05）。

表2 salubrinal 对 PM2.5 刺激的 MH-S 细胞 IL-17 分泌及HDAC2活性的影响Table 2.Effects of salubrinal on IL-17 secretion and HDAC2 activity in MH-S cells stimulated with PM2.5（Mean±SD. n=5）

讨 论

COPD 急性加重期的发病机制可归因于感染和非感染性因素。微生物感染是AECOPD 最常见的原因［1］。大气污染是主要的非感染性因素。

大量研究证实肺泡巨噬细胞在COPD 炎症相关发病机制中起重要作用的细胞类型之一［2-5］。我们前期实验证实带有炎症因子的血清渗出液与肺泡巨噬细胞相互作用，进一步加重肺部炎症［6］。本研究证实血清作用于MH-S 细胞可使其产生炎症反应，IL-17 分泌增多，HDAC2 活性降低，健康志愿者血清刺激MH-S 细胞后炎症因子增多，炎症反应增强，说明健康志愿者血清刺激对细胞的致炎作用明显，但AECOPD患者血清刺激MH-S细胞较健康志愿者血清刺激相比损伤更严重。可能是与AECOPD 患者存在系统性炎症有关，血清中对细胞有毒害作用的炎症因子较多。PM2.5 与血清共同刺激巨噬细胞情况下加重该损害。说明炎症情况下呼吸道黏膜水肿渗出会使 PM2.5 的损伤作用增强，PM2.5 可致使 COPD 急性加重，住院率增多，同时急性加重情况下也更易受PM2.5 损伤。而关于PM2.5 对MH-S 细胞影响的具体机制并不清楚，以及AECOPD 血清与PM2.5 共同作用下使PM2.5对细胞损伤作用增强的具体机制需进一步探究。

内质网（endoplasmic reticulum，ER）是真核细胞中具有关键功能的细胞器，各种生理和病理情况可能导致ER 蛋白折叠负荷和容量之间的不平衡，ER腔中出现未折叠或错误折叠蛋白的积累，细胞启动一系列精密的信号转导途径，这种情况被称为“ERS”［7］。GRP78 是 ERS 的重要标记物，当 ER 稳态被扰乱时，错误折叠的蛋白质与GRP78 结合，激活ER 传感器，产生 PERK-eIF2α、IRE1-XBP1s 和 ATF6-ERSE 3 条信号通路，经一系列信号传递导致ER 腔的扩张和错误折叠蛋白的降解，发挥减轻ERS、保护细胞的作用。CHOP 也是ERS 的重要标记物，PERK-eIF2α-ATF4通路是CHOP 蛋白表达所必须的。正常情况下 CHOP 表达较低，当发生 ERS 时，CHOP 表达明显增多，通过促进内质网腔内未折叠蛋白正确折叠，对细胞产生保护作用。多种炎症相关细胞因子可以激活ERS。在一定浓度范围内，随着PM2.5 浓度增加，肺泡巨噬细胞CHOP 的mRNA、GRP78 的mRNA 表达增多，引起 ERS［8］。salubrinal 是一种选择性细胞复合体抑制剂，可调节PERK-eIF2α 信号通路的活性，促使未折叠蛋白降解，缓解ERS 压力，抑制ERS 所致的细胞凋亡。salubrinal 可降低LPS 诱导CHOP 的 mRNA 表达［9］。Liu 等［10］研究证实 ERS 时，GRP78 表达增多可使CHOP 的表达减少。salubrinal可通过减轻ERS 抑制CHOP、caspase-12 表达起到保护心肌细胞的作用［11］。

本研究应用PERK-eIF2α通路中的eIF2α去磷酸化抑制剂 salubrinal 干预 PM2.5 刺激 MH-S 细胞，观察到单纯PM2.5 刺激时，CHOP 表达荧光增强，进入核内增多，表明PM2.5 诱导MH-S 细胞发生了ERS，当给予 salubrinal 干预后，MH-S 细胞内 CHOP 表达的荧光强度减弱，证明salubrinal对ERS起到抑制作用，减少了CHOP 的表达活化。本研究应用salubrinal 减弱PM2.5 诱导的ERS 过程中的CHOP 荧光强度，同时 IL-17 分泌减少，HDAC2 活性增强，salubrinal 有可能是通过减少CHOP 表达来起到了抑制PM2.5 所致炎症的过程，有待进一步研究。用salubrinal 干预PM2.5 刺激的 MH-S 细胞，GRP78 表达增高，这与Chen 等 的 研 究 结 果 一 致［12］。 加 入 salubrinal 后GRP78 增高可能体现了其保护性作用。GRP78 参与多种细胞生理过程。它是一种抗凋亡蛋白，并且在细胞生存、增殖及转移中发挥重要的作用。但在PM2.5 作用下 salubrinal 诱导的 GRP78 增高对炎症的可能作用及机制并不清楚，有待下一步研究。salubrinal减少IL-17的释放，提高HDAC2活性，可能为改善慢阻肺激素抵抗提供新的治疗思路。