大黄素通过调控ROS/TXNIP/NLRP3轴介导的细胞焦亡途径减轻重症肺炎大鼠肺损伤*

王亚静， 张 静， 宋卫卫， 高延秋

（郑州大学附属郑州中心医院 1呼吸康复科，2呼吸重症科，河南郑州450006）

肺炎是威胁人类健康的重要疾病之一，主要是由细菌、病毒等病原体引起肺部感染造成，肺炎的严重程度取决于肺部炎症程度、肺部炎症的扩散程度等，出现严重低氧血症、急性呼吸衰竭、低血压和休克等不良表现即可认定为重症肺炎，重症肺炎时肺组织产生大量炎症因子，机体炎症反应过度激活，引发全身炎症反应，因此寻找具有抗炎作用的药物对于缓解重症肺炎具有积极作用［1-2］。大黄素是中药大黄的干燥根和茎中有效活性成分之一，具有抗炎、止血、降血脂和抗氧化等多种生物活性［3］。Dai 等［4］的研究显示大黄素可显著提高甲型流感病毒肺炎小鼠的存活率，减轻肺水肿程度，抑制机体炎症反应及氧化应激反应，对小鼠的肺组织具有一定的保护作用。但关于其可能的机制报道却较少。资料显示，急性肺损伤可导致机体炎症反应加剧及活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的过度产生，进而促进硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）的表达，TXNIP 参与核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎症小体的激活，促进细胞内炎性因子的释放，最终导致细胞焦亡［5-6］。Meng 等［7］证实，洋地黄黄酮对于缓解脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤具有积极作用，并认为它可能是通过减少机体ROS 产生、抑制NLRP3 炎症小体的激活而发挥作用的。因此，本项工作在前人研究的基础上探究大黄素对重症肺炎大鼠肺损伤的影响是否与ROS/TXNIP/NLRP3 通路相关，以期为重症肺炎的治疗提供参考资料。

材料和方法

1 动物

40只SD 雄性大鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司），SPF级，8周龄，体质量230～260 g，生产许可证号为SCXK（京）2016-0011。所有大鼠在干净整洁的环境中饲养，12 h 昼夜交替，自由饮食、饮水，温度约25 ℃，相对湿度约50%，定时清洁鼠笼。在实验过程中按照动物使用的“3R”原则给予人道主义关怀。本研究经动物伦理委员会批准同意。

2 主要试剂

ROS 激活剂氧化三甲胺（trimethylamineN-oxide，TMAO）和大黄素购于陶素生化；HE 染色试剂盒、高效RIPA 裂解液和BCA 蛋白浓度测定试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）和IL-1β ELISA 试剂盒及ROS 检测试剂盒购于上海碧云天公司；兔源TXNIP、NLRP3、含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）、caspase-1 和 GAPDH Ⅰ抗及羊抗兔IgG Ⅱ抗购于Abcam。G-100 血气分析仪（深圳市西尔曼科技有限公司）；XElx800 酶标仪（PerkinElmer）；Trans-Blot SD 半干转膜仪（Bio-Rad）；GIS-500凝胶成像仪（Miulab）。

3 主要方法

3.1 动物模型制备及分组给药 重症肺炎大鼠模型的构建参考文献［8］方法制备，将肺炎克雷伯杆菌浓度调整为1.5×1012CFU/L，将大鼠用2%的戊巴比妥钠麻醉后固定，常规消毒后切开颈部皮肤，使气管暴露，用注射器将0.15 mL 的肺炎克雷伯杆菌液由气管滴入，将大鼠保持直立位20 s 以保证菌液进入肺部，当观察到大鼠呼吸急促、呆滞、反应迟钝，出现严重的低氧血症时（SaO2＜90%）认为重症肺炎模型构建成功。40 只SD 大鼠随机分为对照（control）组、模型（model）组、大黄素（emodin）组［9］、TMAO 组［10］和emodin+TMAO 组，每组8 只，除对照组外其余各组均构建大鼠重症肺炎模型，对照组以生理盐水替代菌液，其余操作均相同。大黄素组大鼠每天灌胃80 mg/kg 大黄素，TMAO 组大鼠每天灌胃110 mg/kg TMAO 溶液，大黄素+TMAO 组大鼠每天灌胃80 mg/kg 大黄素后再灌胃110 mg/kg TMAO 溶液，持续灌胃2周，对照组和模型组以生理盐水替代。

3.2 大鼠动脉血气分析 末次灌胃结束后24 h，将大鼠麻醉后采用肝素抗凝管取血1 mL，用全自动血气分析仪分析各组大鼠动脉血二氧化碳（carbon dioxide，CO2）含量、动脉 CO2分压（arterial CO2partial pressure，PaCO2）、动脉血氧饱和度（arterial blood oxygen saturation，SaO2）和动脉氧分压（arterial oxygen partial pressure，PaO2）。

3.3 大鼠肺泡灌洗液和肺脏组织的采集 将大鼠麻醉处死，胸部皮肤常规消毒，剪开胸部皮肤暴露胸腔，结扎大鼠右侧支气管，将磷酸盐缓冲液由左侧主气管注入左侧肺泡，观察到大鼠肺部膨隆后抽回缓冲液，反复冲洗 3 次，合并缓冲液，250×g离心 10 min，上清液用于炎症因子水平的测定，沉淀物用于炎症细胞的分类计数。取大鼠右侧肺组织，一部分用于HE 染色，一部分用于ROS/TXNIP/NLRP3 通路相关指标的测定。

3.4 大鼠肺组织HE 染色观察 取适量大鼠肺组织，于4%甲醛溶液中固定48 h，采用自动组织脱水机将肺组织进行脱水、透明处理，常规石蜡包埋并切成4 μm 厚的薄片，贴附在载玻片上，参考HE 染色试剂盒的要求进行操作，主要包括脱蜡至水、苏木素染色、分化、返蓝、伊红染色、封片等操作，于显微镜下观察并分析。

3.5 大鼠肺泡灌洗液中炎症因子及炎症细胞测定 取大鼠肺泡灌洗液上清，用ELISA试剂盒检测其中TNF-α、IL-6及IL-1β水平，具体操作按照相关试剂盒的说明书进行。取大鼠肺泡灌洗液沉淀物，用生理盐水重悬后均匀涂抹于载玻片中央，干燥后用瑞氏染液染色3 min，水洗，干燥后用中性树胶进行封片，于显微镜下选取200个白细胞，由经验丰富的细胞形态学检测人员统计其中嗜酸性粒细胞（eosinophils，EOS）、淋巴细胞和中性粒细胞等各类白细胞的数目。

3.6 大鼠肺组织ROS/TXNIP/NLRP3 通路相关指标检测 取大鼠肺组织，剪碎后制成组织匀浆，采用ROS 试剂盒测定其中ROS 活性，具体操作参考相关试剂盒的要求进行。取剩余大鼠肺组织，剪碎后加入高效RIPA 裂解液提取总蛋白，用BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白质含量，将蛋白样品用蛋白上样液调成相同浓度，高温加热至蛋白变性，SDS-PAGE 分离蛋白，湿转法将分离的蛋白转移至NC膜上，于5%脱脂奶粉溶液中封闭处理，加入兔源TXNIP、NLRP3、ASC、caspase-1 和 GAPDH Ⅰ抗，4 ℃孵育过夜，用TBST 缓冲液冲洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG Ⅱ抗，室温孵育1 h，经TBST 缓冲液冲洗后显色、定影，于凝胶成像仪中观察、拍照并分析。

4 统计学处理

以SPSS 22.0软件对实验数据进行统计分析，计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两组间比较行LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各组大鼠动脉血气分析情况

与对照组相比，模型组大鼠PaCO2显著升高（P＜0.05），CO2含量、PaO2和SaO2显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，大黄素组大鼠PaCO2显著降低（P＜0.05），CO2含量、PaO2和SaO2显著升高（P＜0.05）；模型组与TMAO 组相比上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）；与大黄素组相比，emodin+TMAO 组大鼠PaCO2显著升高（P＜0.05），CO2含量、PaO2和 SaO2显著降低（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠血气分析指标比较Table 1.Comparison of blood gas analysis of the rats in each group（Mean±SD. n=8）

2 各组大鼠肺组织HE染色观察

对照组大鼠肺组织无明显病变，结构完整；模型组大鼠肺组织损伤较严重，存在炎症细胞浸润、肺间质增厚、肺泡萎陷等现象；与模型组相比，大黄素组大鼠肺组织受损得到一定恢复，模型组与TMAO 组肺组织病理表现相当；与大黄素组相比，emodin+TMAO组大鼠肺组织恢复效果较差。见图1。

Figure 1.HE staining of lung tissue in each group.Red arrows indicated alveolar collapse；yellow arrows indicated inflammatory cell infiltration；blue arrows indicated thickening of lung interstitium.The scale bar=100 μm.图1 各组大鼠肺组织HE染色图片

3 各组大鼠肺泡灌洗液中炎症因子水平比较

与对照组相比，模型组大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，大黄素组大鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著降低（P＜0.05）；模型组与TMAO 组相比，TNF-α、IL-6 和 IL-1β 水平差异无统计学意义（P＞0.05）；与大黄素组相比，emodin+TMAO 组大鼠肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 水平显著升高（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠肺泡灌洗液中炎症因子水平比较Table 2.Comparison of inflammatory factors in alveolar lavage fluid of the rats in each group（ng/L.Mean±SD. n=8）

4 各组大鼠肺泡灌洗液中炎症细胞的分类比较

与对照组相比，模型组大鼠肺泡灌洗液中EOS、淋巴细胞和中性粒细胞显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，大黄素组大鼠肺泡灌洗液中EOS、淋巴细胞和中性粒细胞显著降低（P＜0.05）；模型组与TMAO组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；与大黄素组相比，emodin+TMAO 组大鼠肺泡灌洗液中EOS、淋巴细胞和中性粒细胞显著升高（P＜0.05），见表3。

表3 各组大鼠肺泡灌洗液中炎症细胞比较Table 3.Comparison of inflammatory cells in alveolar lavage fluid of the rats in each group（×106/L.Mean±SD. n=8）

5 各组大鼠肺组织ROS/TXNIP/NLRP3 通路相关指标的比较

与对照组相比，模型组大鼠肺组织中ROS 活性及 TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，大黄素组大鼠肺组织中ROS 活性及 TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白水平显著降低（P＜0.05）；模型组与TMAO 组相比上述指标差异无统计学意义（P＞0.05）；与大黄素组相比，emodin+TMAO 组大鼠肺组织中ROS 活性及TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白水平显著升高（P＜0.05），见表4及图2。

表4 各组大鼠肺组织ROS活性及ROS/TXNIP/NLRP3通路相关蛋白表达的情况Table 4.ROS activity and ROS/TXNIP/NLRP3 pathway-related protein expression in lung tissues of the rats in each group（Mean±SD. n=8）

Figure 2.Expression of ROS/TXNIP/NLRP3 signaling pathwayrelated proteins in the rats of each group.图2 各组大鼠ROS/TXNIP/NLRP3通路相关蛋白表达情况

讨 论

肺炎是由微生物、多种理化因素等造成的肺泡、肺间质炎症性疾病，常见的为细菌性肺炎。重症肺炎患者机体炎症反应程度、肺部炎症扩散程度较高，有严重低氧血症、低血压、急性呼吸衰竭等不良表现，具有较高的病死率［11-12］。肺炎克雷伯杆菌是一种革兰氏阴性菌，是常见的毒性较强的病原菌之一，本研究通过气管滴入肺炎克雷伯杆菌构建大鼠重症肺炎模型，结果显示，模型组大鼠动脉血PaCO2值显著高于正常组大鼠，动脉血CO2含量、PaO2和SaO2值显著低于正常组大鼠，HE 染色结果显示模型组大鼠肺组织损伤较严重，存在炎性细胞浸润、肺泡萎缩，肺间质增厚等现象，肺泡灌洗液中炎性因子（TNF-α、IL-6 和IL-1β）及炎性细胞显著增多，提示肺炎克雷伯杆菌可造成大鼠肺部炎症反应加剧，导致大鼠出现严重低氧血症，表明大鼠重症肺炎模型构建成功。

重症肺炎与肺部炎症反应联系密切，大黄素是蒽醌类衍生物，是植物大黄根茎中的有效活性成分之一，具有抗炎、降血脂、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、抗糖尿病和免疫调节等多种生物活性，对于急性胰腺炎、哮喘、牙周炎、脂肪肝、糖尿病等疾病有潜在的治疗价值［13-14］，资料显示大黄素具有广谱抗菌、抗病毒的药理作用，主要通过抑制病毒的吸附、穿入过程抑制病毒复制，用于治疗新型冠状病毒肺炎具有一定的可能性［15］。Pang等［16］研究显示大黄素可通过降低TNF-α 和IL-1β 等炎症因子水平、抑制肺泡上皮细胞凋亡、调节上皮间质转化等途径减轻二氧化硅引起的肺损伤及肺纤维化，谢璟等［17］研究表明大黄素可显著降低肺炎链球菌肺炎小鼠肺组织炎症反应，降低小鼠肺组织中TNF-α、IL-1β 和 IL-6 等炎症因子水平，进而减轻肺组织损伤。本研究结果显示，经过大黄素处理的重症肺炎大鼠动脉血PaCO2、肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 水平、炎症细胞数量及 ROS活性显著降低，动脉血CO2含量、PaO2和SaO2显著升高，肺组织损伤减轻，提示大黄素可显著改善重症肺炎大鼠的严重低氧血症，抑制机体炎症反应，对重症肺炎大鼠损伤肺组织具有一定的保护作用。

多项研究表明ROS/TXNIP/NLRP3 通路与焦亡及炎症反应联系密切，肺炎克雷伯杆菌可诱导机体产生大量的ROS，ROS 的过度产生可促进TXNIP 的表达，TXNIP 参与NLRP3 炎症小体的激活及促炎因子的成熟和分泌，NLRP3 炎症小体信号是一类大分子多蛋白复合体，由 NLRP3、ASC 和 caspase-1 组成，可识别机体危险信号，激活的NLRP3 可通过ASC 招募caspase-1，促进其水解形成有活性的caspase-1，典型的焦亡是由有活性的caspase-1 介导的，caspase-1可促进IL-1β 等炎症因子的释放，加剧炎症反应，引起组织、细胞的焦亡［18-19］。Jiang 等［20］研究发现脂多糖可引起小鼠肺组织炎症反应加剧，引发肺损伤，导致肺组织中 ROS 活性、TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白表达增加，Han 等［21］研究发现抑制机体ROS 活性、下调肺组织中TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白表达对于缓解脂多糖诱导的急性肺损伤具有一定的促进作用。本研究结果显示，模型组大鼠肺组织中 ROS 活性、TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1蛋白表达显著高于正常大鼠，经过大黄素治疗后大鼠肺组织炎症及损伤得到缓解，肺组织中ROS活性、TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白表达显著降低，ROS 激活剂TMAO 单独处理与模型组大鼠各指标差异不显著，提示模型大鼠体内ROS/TXNIP/NLRP3 通路可能已处于充分激活状态，但是大黄素和ROS 激活剂TMAO 联合处理与大黄素单独处理相比，大鼠肺组织炎症及损伤加重且ROS 活性、TXNIP、NLRP3、ASC 和 caspase-1 蛋白表达显著升高，提示大黄素缓解重症肺炎大鼠肺损伤的作用可能与抑制ROS/TXNIP/NLRP3通路有关。

综上所述，大黄素可缓解重症肺炎大鼠的肺部炎症及肺损伤，可能与抑制ROS/TXNIP/NLRP3 通路有关，而大黄素作用机制复杂，是否亦通过其他途径发挥作用仍不清晰，故而后续需更深入的研究。