罗哌卡因通过抑制STAT3的磷酸化诱导PC12细胞线粒体自噬*

曾 炼， 刘晨光， 孙晓东， 丁旭东， 桑 明， 罗辉宇

（湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院，湖北襄阳441000）

罗哌卡因（ropivacaine）作为酰胺类局麻药的代表，被广泛应用于周围神经阻滞，椎管内麻醉以及疼痛治疗［1］。流行病学的研究发现罗哌卡因在大剂量和长时间的作用下会产生神经毒性，而目前尚无安全有效的预防及治疗措施［2-3］。罗哌卡因诱导神经毒性涉及多种机制，包括神经元钙超载，神经元凋亡以及神经元自噬［3-6］。线粒体自噬（mitochondrial autophagy，mitophagy）属于细胞自噬的特殊类型，其目的在于去除受损的线粒体。理论上，适度的线粒体自噬可以维持神经元内稳态，但当线粒体自噬过度激活时，会导致神经元线粒体功能进行性的损害，最终诱导神经元死亡［7-8］。在罗哌卡因诱导神经元损伤的过程中，已有研究证实罗哌卡因会导致神经元线粒体功能障碍［9-11］，但尚无研究报道其对于神经元线粒体自噬的作用，同时研究表明信号转导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）可以通过第727 位点丝氨酸的磷酸化保护神经元线粒体功能，抑制过度的线粒体自噬［12-13］。故此，本项工作旨在探讨罗哌卡因对大鼠嗜铬细胞瘤PC12 细胞线粒体自噬及STAT3 磷酸化的作用。

材料和方法

1 实验材料

PC12 细胞购自于中科院上海细胞库；盐酸罗哌卡因（原料药，纯度：99.99%，恒瑞医药）；高糖DMEM 培养液和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自Gibco；Cell Counting Kit-8（CCK-8）购自Biosharp；活性氧（reactive oxygen species，ROS）分析试剂盒和JC-1 线粒体膜电位检测试剂盒（KeyGEN BioTECH）；抗p-STAT3 及STAT3 抗体（Proteintech）；抗α-tubulin及 GAPDH 抗体（Abcam）；抗 PINK1、parkin、LC3 及P62抗体（Wanleibio）；DyLight 488绿色荧光II抗（Abcam）；HRP 标记的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG、细胞核染料Hoechst 33258 及线粒体红色荧光探针Mito-Tracker Red CMXRos（Beyotime）。

SpectraMax i3x 酶标仪（Molecular Devices）；IX70倒置荧光显微镜（Olympus）。

2 方法

2.1 细胞培养 PC12 细胞培养于含10% FBS、1×105U/L 青和 100 mg/L 链霉素的高糖 DMEM 培养液中，置于5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养，状态良好。待其融合度达80%～90%，用0.25%胰酶消化，进行细胞传代培养或接种。

2.2 CCK-8 实验检测细胞活力 将PC12 细胞按照3×107/L 的密度接种于96 孔板中，待细胞处于对数增长期，参考前期已发表的文章［14］，使用不同浓度的罗哌卡因（0.5、1、2、4 和8 mmol/L）进行处理，另设空白对照组，每组5个复孔，培养 24 h 后，加入CCK-8（每孔10 μL）溶液，反应3 h，荧光酶标仪（激发光波长450 nm）测定每孔吸光度，以空白孔调零，计算细胞相对活力，取对照组细胞活力为1。

2.3 细胞形态学观察 将密度为1×108/L 的PC12细胞接种于12 孔板中，取对数增殖期的细胞进行干预，处理方式同上，培养24 h 后，倒置相差显微镜下观察并拍照。

2.4 线粒体活性氧的测定 将密度为1×108/L 的PC12细胞接种于12孔板中，取对数增殖期的细胞进行干预，处理方式同上，培养24 h 后，参考文献中的方法［15］，使用荧光探针2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFHDA）标记细胞中的活性氧，同时选用线粒体荧光探针MitoTracker Red CMXRos 标记细胞中的线粒体，共同孵育30 min后，加入PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定，使用Hoechst 33258标记细胞核，置于荧光显微镜下进行观察并拍照。

2.5 线粒体膜电位的检测 参考文献中的方法［16］，将密度为 1×108/L 的 PC12 细胞接种于 12 孔板中，取对数增殖期的细胞进行干预，处理方式同上，设空白对照，培养24 h 后弃培养液，PBS 洗涤细胞，加入线粒体膜电位检测试剂盒中的JC-1 工作液覆盖细胞，置于培养箱孵育30 min 后，用新鲜培养液洗涤2 次，PBS 清洗1 次后加入4%多聚甲醛室温固定30 min，再用PBS 清洗2 次后加入Hoechst 33258 标记细胞核，置于荧光显微镜下进行观察并拍照。正常细胞：线粒体膜电位正常，细胞内含大量JC-1 聚合体呈高绿高红的荧光信号；受损细胞：线粒体膜电位降低，细胞中JC-1聚合体减少呈现出高绿低红的荧光信号。

2.6 Western blot 培养于6孔板中的PC12细胞，处理方式同上，设空白对照，培养24 h后弃培养液，PBS洗涤细胞，加入含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，冰上裂解细胞，取上清液，使用BCA 试剂盒测定蛋白浓度，每孔上样蛋白量25 μg，电泳并转膜。转膜完毕后，用含5%脱脂牛奶的TBST 溶液室温封闭2 h，加入 I 抗（p-STAT3，1∶1 000；STAT3，1∶500；α-tubulin，1∶1 000；LC3，1∶1 000；p62，1∶1 000；PINK，1∶1 000；parkin，1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤5 次，每次 3 min，加入 HRP 标记的Ⅱ抗（山羊抗兔IgG，1∶10 000；山羊抗鼠IgG，1∶3 000）室温孵育2 h，TBST 洗涤5次，每次 3 min；加入 ECL 进行显色，使用Bio-Rad凝胶成像系统对灰度值进行定量。

2.7 免疫荧光染色 将密度5×107/L 的细胞接种于多聚赖氨酸包被的载玻片上，罗哌卡因作用24 h后，弃去培养液，用预冷的PBS 洗涤细胞2 次，加入4%多聚甲醛室温固定细胞30 min，PBS 洗涤后使用0.2% Triton X-100 透膜10 min，加入含1%马血清的PBST 溶液室温封闭 2 h，使用抗 p-STAT3 抗体（1∶200）4 ℃孵育过夜，PBST 洗涤 3 次，每次5min，Dy-Light 488绿色荧光Ⅱ抗（1∶1 000）避光室温孵育2 h，PBST 洗涤后Hoechst 33258复染核，置于荧光显微镜下观察并摄片。

3 统计学处理

数据采用SPSS 25 统计软件处理。正态分布的计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示。组间比较采用多样本均数单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 罗哌卡因引起PC12细胞活力下降及形态改变

CCK-8 实验结果显示，与对照组相比，罗哌卡因处理24 h后，随着药物浓度的增加，细胞活力显著降低（P＜0.01），且呈剂量依赖性，其中4 mmol/L罗哌卡因处理24 h 后细胞活力下降约50%，8 mmol/L 罗哌卡因组细胞活力下降约70%（图1）。

Figure 1.The cytotoxicity of ropivacaine on PC12 cells.The PC12 cells were treated with different concentrations of ropivacaine for 24 h，and the cell viability was detected by CCK-8 assay.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 0 mol/L group.图1 罗哌卡因对PC12细胞的细胞毒性作用

光学显微镜的结果显示，从细胞形态上来看，对照组的PC12 细胞呈不规则状，多突起，具有类神经元结构及特征，而随着罗哌卡因浓度的增加，细胞变圆，突起减少，凋亡坏死细胞数量增多（图2）。

Figure 2.The effect of ropivacaine on the morphological changes of PC12 cells.The PC12 cells were treated with different concentrations of ropivacaine for 24 h，and the cell morphological changes were observed under optical microscope.The cells in control group were polygonal with protrusions，and those in ropivacaine group changed to be circular and their protusions were decreased.图2 不同浓度罗哌卡因对PC12细胞形态的作用

2 罗哌卡因诱导PC12细胞线粒体功能障碍

免疫荧光染色结果显示，与对照组比较，罗哌卡因组中代表ROS的绿色荧光强度随药物浓度增加而增加，同时红色荧光标记的线粒体与绿色荧光标记的ROS 间的共定位显著增多，且呈剂量依耐性，以2 mmol/L罗哌卡因组增加最显著，见图3。

Figure 3.The effect of ropivacaine on the production of mitochondrial reactive oxygen species（ROS）.The PC12 cells were treated with different concentrations of ropivacaine for 24 h，and the fluorescent probes H2DCFDA and MitoTracker Red CMXRos were used to label the ROS and mitochondria，respectively.Compared with control group，the cells treated with ropivacaine showed the increases in the green fluorescence intensity and the colocalization of ROS（green fluorescence）and mitochondria（red fluorescence）.图3 不同浓度罗哌卡因对PC12细胞中线粒活性氧生成的作用

此外，图4 的结果显示，与对照组比较，罗哌卡因组中代表JC-1聚合体的红色荧光强度随药物浓度增加而减少，细胞呈现出高绿低红的荧光信号，与高绿高红的正常对照细胞差异显著。

3 罗哌卡因促进PC12细胞线粒体自噬

图5A 中Western blot 的结果显示，与对照组比较，罗哌卡因组PC12 细胞LC3-II/LC3-I 的比值增加，线粒体自噬标志蛋白PINK1 和parkin 的表达随药物浓度增加而增加，自噬底物P62 的蛋白水平显著下降（P＜0.01），且呈剂量依赖性。图5B 中比较了对照组与罗哌卡因组中红色荧光标记的线粒体与绿色荧光标记的LC3 间的共定位水平，结果显示，随着罗哌卡因浓度的升高，LC3 标记的自噬体的数量显著增加，呈点状分布于细胞质中；同时自噬体与Mito-Tracker 标记的线粒体间的共定位也显著增多，呈剂量依赖性，以2 mmol/L增加最显著。

Figure 5.Ropivacaine induced mitophagy in PC12 cells.A：the expression levels of mitophagy-related proteins were detected by Western blot；B：the colocalization of mitochondria（red fluroresence）and LC3（green fluoresence）was detected by fluorescence microscopy.Compared with control group，the cells treated with ropivacaine showed the increase in the colocalization of mitochondria（red fluoresence）and LC3-labeled autophagosomes（green fluoresence）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图5 罗哌卡因促进PC12细胞线粒体自噬

4 罗哌卡因抑制STAT3的磷酸化

图 6C、D 中 Western blot 的结果显示，与对照组比较，罗哌卡因组中总STAT3 的蛋白表达未发生显著变化，而p-STAT3 的蛋白水平随罗哌卡因浓度的升高而逐渐下降，呈剂量依赖性，其中2 mmol/L 罗哌卡因组降低最显著（P＜0.01）。同样的，p-STAT3 的免疫荧光染色结果与上述Western blot 的结果保持一致，如图6A、B 所示，与对照组比较，罗哌卡因组中代表p-STAT3 的绿色荧光强度随药物浓度的升高而下降，以2 mmol/L罗哌卡因组最显著（P＜0.01）。

Figure 6.Ropivacaine inhibited the phosphorylation of STAT3 protein in PC12 cells.A：the protein level of p-STAT3 was detected by immunofluorescence；B：quantification of the fluorescence intensity in A；C：the protein levels of STAT3 and p-STAT3 were detected by Western blot；D：quantification of the gray values in C.Compared with control group，the cells treated with ropivacaine showed decreased p-STAT3 level（green fluoresence）in a dose-dependent manner.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group.图6 罗哌卡因抑制PC12细胞中STAT3蛋白的磷酸化

讨 论

探讨局麻药产生神经毒性的作用机制对预防局麻药引发的神经损伤具有重要意义，本体外实验着重探究了罗哌卡因对大鼠嗜铬细胞瘤PC12 细胞线粒体自噬以及STAT3 磷酸化的作用，结果表明罗哌卡因通过诱导PC12 细胞线粒体功能障碍产生神经毒性，同时罗哌卡因促进了PC12 细胞线粒体自噬，包括增加LC3-II/LC3-I的比值，促进线粒体自噬相关蛋白PINK1 和parkin 的表达，抑制自噬底物蛋白p62的表达。同样的，罗哌卡因抑制了PC12 细胞STAT3的磷酸化，可能作为其发挥上述作用的潜在机制。

作为酰胺类局麻药的代表，罗哌卡因因其具有良好的临床疗效而被广泛地应用周围神经阻滞，椎管内麻醉以及疼痛治疗［17］。然而在椎管内麻醉中可能会产生短暂神经综合征和马尾综合征等毒性反应，但具体机制的尚不清楚。近年来，大量的研究表明罗哌卡因诱导神经毒性涉及多种病理生理过程，包括细胞钙超载，细胞凋亡，氧化应激以及细胞自噬［18-20］。Wen 等［4，21］的研究证实 T 型钙通道及其调节蛋白的激活诱导细胞钙超载作为罗哌卡因产生神经毒性的重要环节，当抑制上述蛋白的表达可以显著减少神经元损伤。除钙超载外，Niu等［10］的研究显示罗哌卡因可以诱导神经元细胞线粒体数量的减少以及氧化磷酸化功能障碍，进一步通过内源性凋亡途径促进细胞凋亡。我们的研究同样证实了罗哌卡因可以诱导PC12 细胞线粒体功能障碍包括增加线粒体活性氧的产生以及降低线粒体膜电位，作为其产生神经毒性的关键环节。除上述因素外，Xiong 等［3］观察到罗哌卡因具有促进细胞自噬的作用，而当抑制自噬时会进一步加重罗哌卡因诱导的细胞损伤，这与我们的结果相吻合。

自噬是细胞降解多余蛋白质及损伤细胞器的生理过程，而线粒体自噬作为细胞自噬的特殊类型，其目的在于去除功能受损及衰老的线粒体，从而维持线粒体质量与功能的稳定［22］。线粒体自噬是生命体进化出的有效清除机制，适度的线粒体自噬可以帮助细胞清除受损的线粒体，以保证能量的供应，而当线粒体自噬过度激活时，会进一步加重细胞损伤，包括诱导线粒体活性氧的生成以及降低线粒体膜电位，最终导致细胞死亡［23-24］。线粒体自噬受多种信号分子的调控［25］，这其中也包括 STAT3。Yang 等［26］的研究证实激活STAT3通路可以抑制缺血再灌注损伤诱导的神经元凋亡，减少线粒体活性氧的产生，从而抑制过度的细胞自噬。作为IL-6 激活基因的转录增强子，STAT3 具有广泛的生物学功能，有研究指出STAT3 与神经系统的发育与分化密切相关［27］，同时其在神经元损伤的过程中也发挥重要作用，磷酸化的 STAT3 能够显著保护受损的神经元，Chen 等［28］的研究显示当使用IL-6 信号转导抑制剂抑制STAT3 的磷酸化过程可以导致脑卒中小鼠缺血半暗带中受损神经元的增多，进一步加重神经元受损。然而在罗哌卡因诱导神经毒性的研究中，目前尚无关于STAT3 的报道。故本研究探讨了罗哌卡因对PC12细胞线粒体自噬和STAT3 信号通路的作用，结果显示罗哌卡因在激活细胞线粒体自噬同时抑制了细胞中STAT3 的磷酸化，于是我们提出罗哌卡因可能是通过抑制STAT3 磷酸化诱导PC12 细胞线粒体自噬的假说。