过表达miR-302诱导结肠癌细胞促炎水平升高、线粒体氧化应激并抑制裸鼠成瘤的研究

张小路，杜梅红，彭银杰，万 鑫，张建刚，岳大成，刘 新，王世东

结肠癌(colon cancer，CC)是常见于结肠部位的消化道恶性肿瘤，发病率占胃肠道肿瘤第3位，病死率占所有恶性肿瘤的第5位，复发和转移是患者死亡的主要原因。因此，寻找治疗CC安全有效的方法，具有重要意义。

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一种内源性非编码RNA分子，长度约为23个碱基的小分子单链RNA，对机体的基因表达调控具有重要作用。可作为恶性肿瘤诊断、预后判断的生物标志物以及临床治疗的重要靶点。Erkul et al的研究表明miR-21在喉癌的诊断方面具有重要作用；Yu et al指出miR-224可抑制PTX3蛋白表达防止宫颈癌的发生。其中，miR-302在肿瘤和炎症等方面的调控作用也备受关注。该实验探讨过表达miR-302诱导CC细胞SW480对炎症水平、线粒体氧化应激及裸鼠成瘤的影响，以期为CC的临床治疗提供新思路。

1 材料与方法

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1 材料

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实验细胞与动物 人CC细胞SW480购自北京中科院肿瘤细胞库。实验动物SPF级，无胸腺裸鼠12只，雄性，3周龄，体质量18～20 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号:SCXK(京)20170022，肿瘤造模前适应性饲养1周。

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试剂与仪器 RPMI 1640、0.25%胰蛋白酶、青/链霉素双抗、10%胎牛血清均购自美国Gibco公司；miRNA-302引物序列、miR-NC对照质粒、转染试剂盒、RNA提取试剂盒、BCA蛋白定量检测试剂盒、PCR试剂盒均购自武汉默沙克生物科技有限公司；丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)、白介素(interleukin，IL)-6试剂盒、IL-1β试剂盒、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric ocide synthase,iNOS)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factors，TNF)-α试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；4%多聚甲醛固定液PBS缓冲液购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)购自上海碧云天生物技术有限公司；Navios流式细胞分析仪购自中国贝克曼库尔特商贸有限公司；Rt2100c酶标检测仪购自美国BioTeK伯腾仪器公司。

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2 方法

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细胞培养 将水浴融化后的CC细胞SW480，培养于10%胎牛血清、1%青/链霉素溶液的RPMI 1640培养基中，经离心、重悬后转移至T25培养瓶中，调节培养箱环境为37 ℃、5% CO，细胞铺满瓶底80%时，用0.25%胰蛋白酶消化处理，细胞处于对数生长期进行实验。

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细胞转染与分组 将细胞CC细胞SW480随机分成3组，空白对照组(Control组)、阴性对照组(miR-NC组)、过表达组(miR-302 mimic组)。Control组加等体积培养液，其余两组分别按照miR-NC、miR-302 mimic Lipofecta mine2000试剂盒的操作说明，进行转染处理，细胞培养48 h后，进行后续实验。

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qRT-PCR检测miR-302表达 取1.2.2对数生长期的细胞，经消化、离心、重悬后，将细胞稀释至5×10个/ml，分别取100 μl，接种于96孔板，即控制每孔5 000个细胞，置培养箱24 h(37 ℃,5% CO)，弃培养液。按照RNA提取试剂盒说明，提取总RNA及miRNA，进行反转录(37 ℃，1 h)，配制产物，PCR扩增处理后，以2法计算miR-302的相对表达水平,重复3次。

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ELISA检测促炎因子水平 对数生长期的细胞，按照1.2.3将细胞进行稀释处理后，分别按照IL-6、iNOS试剂盒说明进行操作，用酶标仪进行检测。

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qRT-PCR检测促炎因子mRNA表达 同1.2.3，根据相应试剂盒说明，分别进行引物设计、总RNA提取、反转录、定量PCR，以2法计算IL-1β、TNF-α的相对mRNA表达水平,重复3次。

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流式检测线粒体膜电位变化 对数生长期的细胞，按照1.2.3将细胞进行稀释处理后，根据线粒体膜电位检测试剂盒说明进行操作，加入JC-1荧光探针染液，于37 ℃,5% CO的培养箱中培养20 min，洗去染色液后，用流式细胞仪进行检测。

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试剂盒检测氧化应激标记物水平 对数生长期的细胞，按照1.2.3将细胞进行稀释处理后，分别按照MDA、LDH试剂盒说明进行操作。

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Western blot检测线粒体损伤相关蛋白表达 对数生长期的细胞，按照1.2.3将细胞进行稀释处理后，加入裂解液处理30 min，收集细胞，离心15 min(4 ℃，12 000 r/min)，收集上清液。按照BCA试剂盒说明，进行蛋白定量。取样后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、洗膜、一抗、二抗处理后，加入显色剂进行检测。

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建立裸鼠移植瘤模型 将12只裸鼠随机分为miR-NC组及 miR-302 mimic组，每组6只。取1.2.2对数生长期的细胞，经消化、离心、重悬后，将细胞稀释至2×10个/ml，按照文献方法，分别接种于两组裸鼠右侧距腋下0.5 cm处，每只0.2 ml，5周后处死，剥离肿瘤组织并称量。

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qRT-PCR检测miR-302的表达 取各组裸鼠肿瘤组织样本50 mg，采用匀浆仪充分研磨，离心取上清(12 000 r/min，10 min)，加入100 μl三氯甲烷充分混匀，再次离心，取上清液，加入等体积异丙醇，离心后收集沉淀，再根据试剂盒进行转录、反转录、定量PCR,以2法计算miR-302的相对表达水平,重复3次。

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免疫组化检测caspase 3阳性表达 将各组裸鼠肿瘤组织样本采用多聚甲醛固定，制成组织切片，经脱蜡、水化、HO封闭、抗原修复、封闭、抗体孵育、显色、复染、脱水、透明、封片等处理后，在显微镜下观察，用免疫组化图像分析软件进行统计。

2 结果

2.1 过表达miR-302在SW480细胞中的验证结果

与Control组相比，miR-NC组miR-302表达差异无统计学意义；与miR-NC组相比，miR-302 mimic组miR-302表达升高(

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<0.05,图1)。

图1 各实验组对SW480细胞miR-302表达量的影响

2.2 过表达miR-302对SW480细胞促炎因子合成的影响

Control组相比，miR-NC组IL-6、iNOS水平差异无统计学意义，与miR-NC组相比，miR-302 mimic组炎症因子IL-6、iNOS水平升高(

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<0.05，图2A)；与Control组相比，miR-NC组差异无统计学意义，与miR-NC组相比，miR-302 mimic组IL-1β和TNF-α mRNA 表达水平上升(

P

<0.05，图2B)。实验表明，miR-302过表达诱导CC细胞促炎水平升高，炎症反应明显。

图2 各实验组对SW480细胞促炎因子的影响

2.3 过表达miR-302对SW480细胞线粒体膜电位、氧化应激水平的影响

与Control组相比，miR-NC组线粒体膜电位变化及氧化应激标记物水平差异无统计学意义，与miR-NC组相比，miR-302 mimic组红色荧光细胞向绿色荧光细胞转变较明显(图3A)，绿色荧光细胞百分比增加(

P

<0.05，图3B)，表明线粒体膜电位下降；与miR-NC组相比，miR-302 mimic组LDH及MDA水平明显上升(

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<0.05，图3C、D)。实验提示，miR-302过表达诱导CC细胞线粒体膜去极化的效果明显、氧化应激反应增强，促进线粒体损伤。

图3 各实验组对SW480细胞线粒体膜电位变化及氧化应激标记物水平的影响

2.4 过表达miR-302对SW480细胞线粒体损伤的影响

与Control组相比，miR-NC组，线粒体膜损伤相关蛋白表达水平差异无统计学意义，与miR-NC组相比，miR-302 mimic组Bax/Bcl2、Cleaved cas3/cas3表达明显上升，c-Myc表达明显降低(

P

<0.05，图4)。实验表明，miR-302过表达诱导CC细胞线粒体损伤，与2.3结果吻合。

图4 各实验组对SW480细胞线粒体损伤标记物表达量的影响

2.5 过表达miR-302对SW480细胞裸鼠成瘤的影响

与miR-NC组相比，miR-302 mimic组裸鼠肿瘤组织质量明显降低(

P

<0.05，图5A、B),miR-302表达明显升高(

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<0.05，图5C),caspase 3阳性表达率明显升高(

P

<0.05，图5D、E)。实验表明，miR-302过表达诱导CC细胞抑制裸鼠肿瘤的生长。

图5 各实验组对SW480细胞裸鼠成瘤的影响

3 讨论

目前，miRNA在恶性肿瘤的诊断、治疗、预后中运用广泛，其中Wang et al的研究表明通过调控miR-203可以阻止CC细胞的转移；Yuan et al指出miR-136的过表达抑制CC细胞SW480的增殖和侵袭。因此，miRNA对CC的靶向治疗具有良好的潜力。

IL-6、iNOS、IL-1β、TNF-α均是生物体内炎症反应的敏感指标。其中，iNOS是体内NOS活性氧自由基产生的催化酶，反映体内的炎症程度。An et al指出miR-106能够调节TNF-α、IL-1、iNOS水平缓解心脏内皮细胞炎症的发生；而Chen et al的研究显示通过诱导炎症因子IL-1β、TNF-α的表达干扰口腔癌细胞的增殖。该实验中miR-302 mimic组IL-6、iNOS水平明显升高，IL-1β和TNF-α mRNA 表达量明显上升，与上述研究一致。提示miR-302过表达诱导CC细胞促炎水平升高，炎症反应明显，干扰CC细胞正常生长。

MDA是自由基发生过氧化反应的产物，是脂质过氧化程度及膜系统受损程度的体现。LDH是生物体内糖酵解途径中至关重要的氧化还原酶。当线粒体膜电位不平衡，Bcl-2及Bax的高表达促进膜电位的耗散，导致膜穿透性的改变，线粒体表面发生聚合并形成孔道，使促凋亡因子和细胞色素C释放入细胞质引发凋亡。Kao et al的研究表明miR-31靶向SIRT3破坏口腔癌细胞的线粒体活性并增加氧化应激；有研究指出通过氧化应激、线粒体膜电位丧失诱导癌细胞凋亡，抑制癌症疾病发展。该实验中miR-302 mimic组CC细胞膜电位降低、MDA与LDH水平升高、线粒体损伤相关蛋白表达量变化，与上述研究一致。提示miR-302过表达诱导CC细胞膜电位去极化、诱导氧化应激反应、促进线粒体损伤，破坏CC细胞的生理结构完整，抑制肠癌发展进程。

caspase 3在Caspase级联反应中发挥凋亡执行作用，活化后通过特异性的裂解底物促进凋亡的发生。王俭 等的研究表明miR-23a通过促进肺癌A549细胞凋亡蛋白caspase 3表达，抑制其肿瘤细胞增殖和扩散的能力；Wu et al的报道表明miR-421通过靶向caspase 3调控BGC-823胃癌细胞的凋亡。该实验中miR-302 mimic组裸鼠肿瘤组织质量明显降低，caspase 3阳性表达率明显升高，与上述研究一致，提示过表达miR-302诱导CC细胞抑制裸鼠肿瘤的生长，促进SW480细胞凋亡。