沉默HE4对结肠癌细胞增殖、侵袭、凋亡和JAK/STAT3信号通路的影响

王 韬，王一飞，李 磊，田宝华，李 璐，费建东

结肠癌是消化系统中最常见的恶性肿瘤之一。人附睾蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)在肺癌、乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌中高表达，并且参与了肿瘤的恶性增殖和进展。HE4在结肠癌中的报道相对较少，Kemal et al研究表明，结直肠癌患者外周血清中HE4表达水平明显高于健康人，对结直肠癌的早期诊断有一定价值。赵渊博 等应用表面增强激光解吸电离飞行时间质谱蛋白质芯片联合激光显微切割技术，证实了HE4是大肠癌肝转移的早期标志蛋白。Janus激酶/信号转导子和转录激活子3(janus kinase/signal transducers and activators of transcription 3，JAK/STAT3)信号通路与结肠癌细胞的进展密切相关，HE4可以靶向调控JAK/STAT3信号通路。该研究旨在探讨沉默HE4对结肠癌细胞增殖、侵袭、凋亡和JAK/STAT3信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1

.

1

.

1

细胞 结肠癌细胞株Caco-2、SW480、HT-29、HCT-116和正常结肠上皮细胞株HCoePic均购自中科院上海细胞库。

1

.

1

.

2

仪器 胎牛血清和DMEM培养基购自上海生工生物工程股份有限公司；BCA蛋白定量检测试剂盒、凝胶快速制备试剂盒、SP免疫组化试剂盒均购自武汉艾美捷科技有限公司；HE4、JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、β-actin内参抗体均购自北京安诺伦生物科技有限公司；LipoFiterTM脂质体转染试剂购自上海科维创生物科技有限公司；HE4 si-RNA和si-control均购自上海吉马制药有限公司；CCK-8试剂盒、Transwell小室、Annexin-V-FITC/PI凋亡检测试剂盒均购自上海沪震实业有限公司。

1

.

1

.

3

试剂 Axio Imager M2M全自动显微镜为德国卡尔蔡司公司生产；164-5050型电泳仪、CFXConnect荧光定量PCR仪和680型酶标仪均为美国Bio-Rad公司生产；VILBER INFINITY 3026凝胶成像系统为法国VILBER公司生产；FACSCanto Ⅱ型流式细胞仪为美国BD公司生产。

1.2 细胞培养

细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养液中进行培养，置于37 ℃、5 % CO培养箱中。当细胞融合度达80%时进行传代，用胰蛋白酶消化，以1∶3传代。取对数生长期且生长状态良好的细胞进行后续实验。

1.3 病例资料

选取2016年 6月—2018年6月在该院择期根治术治疗的结肠癌患者124例，术前均未接受放化疗，术后均经组织病理学检查确诊。术前采集患者晨起空腹肘静脉血，1 500 r/min、4 ℃条件下离心15 min，收集血清，存储于-70 ℃冰箱。术中留取癌组织及配对的癌旁正常黏膜组织(距离癌组织≥5 cm)，迅速放于液氮中冷冻，存储于-70 ℃冰箱。124例患者中男72例，女52例；年龄46～78(56.03±10.03)岁。另选取同期在该院进行健康体检的正常人40例作为健康对照，入组时抽取空腹肘静脉血，留存血清，其中男29例，女21例；年龄33～64(55.10±8.78)岁。所有受试者均签署知情同意书。

1.4 Western blot检测细胞和组织中HE4的表达水平

细胞：取对数生长期细胞，加入细胞裂解液，冰上裂解20 min后再离心15 min，收集细胞上清液。用BCA法检测蛋白浓度。经SDS-PAGE凝胶电泳后将蛋白转移至PVDF膜上，用脱脂奶粉封闭1 h，孵育一抗(鼠抗人HE4单克隆抗体，1∶500)，4 ℃过夜后弃去一抗，TBST洗膜3次。随后室温孵育二抗，2 h后弃去二抗，TBST洗膜3次。以β-actin作为内参，用ECL发光仪对蛋白进行成像，用Image J软件分析灰度值。组织：随机选取6例癌组织和癌旁组织进行检测。取组织100 mg加入组织裂解液，充分研碎后冰上裂解20 min，离心15 min，收集上清液。其余步骤同上。

1.5 免疫组织化学染色法检测组织中HE4的表达水平

124例组织石蜡标本由该院病理科完成(石蜡切片厚度为4 μm)，取石蜡切片，常规脱蜡水化。将切片放置于枸橼酸盐缓冲液中微波煮沸5 min，冷却至室温。用PBS洗涤2次，再用蒸馏水洗涤2次。滴加3 %过氧化氢除去内源性过氧化物酶，室温孵育10 min。随后用山羊血清封闭10 min，滴加鼠抗人HE4单克隆抗体，4 ℃孵育过夜。滴加生物素标记的二抗，37 ℃下孵育1 h，用PBS洗涤3次。滴加DAB显色液，苏木精复染。经过脱水、透明、封片处理后在显微镜下观察。根据细胞的染色强度及阳性细胞比例判断HE4表达情况：① 阴性染色记0分，浅黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；② 阳性细胞数为0%～10%记1分，11%～50%记2分，51%～80%记3分，81%～100%记4分。将上述2个评分相乘得出最终结果：0～3分为HE4低表达；4～12分为HE4高表达。

1.6 ELISA法检测血清中HE4的表达水平

严格按照ELISA试剂盒说明书进行操作，酶标仪检测时波长设置为450 nm，通过绘制标准曲线计算血清HE4表达水平。

1.7 细胞转染

以2×10个/孔密度将HT-29细胞接种于6孔板中。转染前用PBS洗涤细胞2次，加入1.8 ml无血清培养基。分别用100 μl无血清培养基稀释10 μl LipoFiter和10 ml HE4 si-RNA(或者si-control)，静置5 min后将二者混匀，随后将混合物加入6孔培养板中。转染24 h后进行后续实验。HE4 si-RNA序列为5′-CTCGCTATTCTCGTACCTTCC-3′；si-control序列为5′-GGACGTCCCCACGGCCCTGGAGG-3′。

1.8 CCK-8细胞增殖实验

将HT-29细胞以1×10个细胞/孔的密度接种于24孔板中，用CCK-8试剂盒检测细胞活性，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。细胞培养24、48、72和96 h后，向每孔中添加10 μl CCK-8，培养4 h。用酶标仪在490 nm波长处读取吸光度，反映细胞增殖活性。

1.9 Transwell小室实验检测HT-29细胞侵袭

首先在Transwell迁移板上室铺基质胶，然后将HT-29细胞接种于Transwell小室，以2×10个/ml密度将HT-29细胞加入上室；下室中加入培养基。培养48 h后取出小室，用棉签拭去微孔膜上室的细胞。用PBS冲洗小室3遍。用4 %多聚甲醛固定黏附于下室微孔膜下面的细胞，用结晶紫染色15 min，待干燥后用显微镜进行观察，并计算侵袭细胞数。

1.10 Annexin-V-FITC/PI流式细胞术检测HT-29细胞凋亡

取转染24 h后处于对数生长期的HT-29细胞，制成1×10个/ml的细胞悬液。随后加入5 μl异硫氰酸荧光素，混匀后孵育15 min；再加入2.5 μl碘化丙啶，孵育5 min。最后用流式细胞仪检测凋亡率。

1.11 Western blot检测HT-29细胞中JAK/STAT3通路相关蛋白的变化

检测方法同1.4。实验中JAK1、p-JAK1、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗体稀释500～1 000倍。

2 结果

2.1 HE4在结肠癌细胞、组织和外周血中的表达

结肠癌Caco-2、SW480、HT-29、HCT-116细胞的HE4蛋白相对表达量均高于正常结肠上皮细胞HCoePic，差异有统计学意义(

F

=56.893，均

P

<0.05，图1A)。结肠癌组织HE4蛋白相对表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义(

P

<0.05，图1B)。免疫组织化学染色结果显示，HE4在结肠癌组织中呈阳性表达，组间比较差异有统计学意义(

P

<0.05，图1C)。结肠癌患者血清HE4浓度高于健康人，差异有统计学意义(

P

<0.05，图1D)。

图1 HE4在细胞、组织和血清中的表达

2.2 结肠癌组织中HE4表达水平与临床病理特征的关系

HE4表达水平与性别、年龄、肿瘤大小无关，而与分化程度、TNM分期、淋巴结转移和远处转移有关(

P

<0.05)。见表1。

表1 结肠癌组织中HE4表达水平与临床病理特征的关系

2.3 沉默HE4对HT-29细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

沉默HE4后，HT-29细胞的HE4蛋白表达水平下降(图2)。si-control组细胞增殖活力高于HE4 si-RNA组，差异均有统计学意义(

P

<0.05，图3A)。si-control组侵袭细胞数高于HE4 si-RNA组，差异有统计学意义(

P

<0.05，图3B)。si-control组凋亡率低于HE4 si-RNA组，差异有统计学意义(

P

<0.05，图3C)。

图2 沉默HE4对HT-29细胞HE4蛋白表达的影响

图3 沉默HE4对HT-29细胞的影响

2.4 沉默HE4对JAK/STAT3通路相关蛋白的影响

si-control组和HE4 si-RNA组JAK1、JAK2、STAT3总蛋白的比较差异无统计学意义。si-control组p-JAK1、p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达量均高于HE4 si-RNA组，差异均有统计学意义(

P

<0.05，图4)。

图4 沉默HE4对JAK/STAT3通路相关蛋白的影响

3 讨论

结肠癌是全世界面临的一个严峻的健康问题，尽管近年来结肠癌的诊治手段有了飞速发展，但是患者的总体生存率仍未明显提高。寻找结肠癌的新型分子生物学标志具有重要意义。该研究结果显示，HE4可能成为结肠癌潜在的诊治靶点。

HE4位于人染色体20q12-13，约12 kb，由5个外显子和4个内含子组成。HE4是蛋白酶抑制剂家族成员，广泛表达于人体各个组织，具有免疫调节作用。近年来HE4在肿瘤中的作用引起了广泛注意，HE4在卵巢癌、子宫内膜癌、肺癌、泌尿系统移行细胞癌和乳腺癌患者的外周血中高表达，该研究表明，结肠癌患者外周血清中HE4表达水平高于健康人，这与Kemal et al报道一致。另外，该研究Western blot和免疫组织化学染色检测结果也证实，HE4在结肠癌细胞和组织中高表达。以上提示HE4可能参与了结肠癌的发生，对其早期诊断有重要价值。

HE4与多种肿瘤的进展有关。该研究表明，HE4表达水平与分化程度、TNM分期、淋巴结转移和远处转移有关，提示HE4可能与结肠癌进展有关。HE4在肿瘤中作用的分子生物学机制既往报道较少。Ribeiro et al研究表明，HE4可以通过调控细胞外基质蛋白(SERPINB2、GREM1、LAMC2和LAMB3)促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和黏附。国内周岩 等研究表明，HE4能够通过影响胞外调节蛋白激酶与蛋白激酶B信号通路促进乳腺癌细胞的增殖并抑制凋亡。

HE4在结肠癌中的作用机制既往鲜有报道。JAK/STAT3是肿瘤的经典通路，可介导增殖、分化、迁移和凋亡，并且与机体免疫调节有关，该通路是结肠癌药物开发的热门靶点。既往卵巢癌中的研究表明，HE4可以靶向作用于JAK/STAT3信号通路，敲除HE4可以通过抑制JAK/STAT3信号通路而抑制卵巢癌细胞的增殖和恶性进展。该研究表明沉默HE4后结肠癌HT-29细胞增殖、侵袭力降低，并且凋亡率增加，另外p-JAK1、p-JAK2和p-STAT3蛋白相对表达量下降，提示HE4可能通过JAK/STAT3而发挥作用。