槲皮素对脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮细胞抗氧化和抗炎的影响

占今舜，霍俊宏，詹 康，赵国琦，武艳平，马月辉

（1.江西省农业科学院畜牧兽医研究所,江西南昌 330200；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100093；3.扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州 225009）

槲皮素是一种广泛存在于植物的花、叶和果实中的多羟基黄酮类化合物，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗肿瘤等生物功能[1]。在肉羊饲粮中添加槲皮素，能够调控瘤胃菌群结构，促进瘤胃发酵，提高营养物质消化率，进而提高饲料利用率；能够提高机体抗氧化能力和免疫力，改善肉品质[2-4]。瘤胃是反刍动物营养消化和吸收的主要场所，瘤胃上皮在营养物质吸收和运输、瘤胃壁保护等方面发挥重要的生理作用[5]。反刍动物采食高比例易发酵的碳水化合物饲粮后，可能会出现瘤胃酸中毒，促使瘤胃脂多糖(LPS)浓度升高，导致瘤胃上皮屏障受损，引发消化道内源LPS移位，进而引发宿主炎症[3]。给山羊饲喂高精料(精粗比75∶25)饲粮中添加槲皮素，能够下调山羊肝脏和蹄组织炎症因子(IL-1β、TNF-α)基因表达水平，增加肝脏IL-10的表达水平。有研究结果表明，槲皮素能够提高山羊组织的抗炎能力，有预防蹄叶炎的作用[6]。体外研究发现，LPS能够抑制山羊瘤胃上皮细胞增殖，上调细胞炎性细胞因子的表达，导致细胞产生炎症反应[7]。前期研究发现，苜蓿黄酮和苜蓿素等黄酮类化合物能够通过调控TLR/MyD88信号通路来缓解LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞的炎症损伤[8-9]。然而，槲皮素是否能够保护山羊瘤胃上皮细胞免受炎性损伤尚不清楚。因此，研究槲皮素对LPS刺激下山羊瘤胃上皮细胞抗氧化和抗炎症的影响，可以为今后合理利用槲皮素来缓解反刍动物瘤胃酸中毒提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

槲皮素(HPLC≥99%)和脂多糖(LPS，血清型O55:B5)均购于美国Sigma 公司，细胞培养级的二甲基亚砜(DMSO)购于北京索莱宝公司；试验所用原代瘤胃上皮细胞来自波尔山羊，由扬州大学动物培养物保藏与应用研究所提供。

1.2 试验方法

1.2.1细胞活性检测

试验于2019年9月开始，细胞活性采用CCK-8法进行检测。将山羊瘤胃上皮细胞接种到96孔板中，每孔数量为1×105个·mL−1，细胞在37℃，5%CO2培养箱中进行培养。待细胞贴壁后，去除培养基，磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗后加入分别含0、5、10、20、40、60、80、120、160和320μg·mL−1槲皮素的DMEM/F12基础培养基，每组5个重复，其中槲皮素用DMSO溶解，每组的DMSO含量为1‰。细胞培养6 h 后，每孔中加入10μL CCK-8溶液，在培养箱中孵育3 h 后，用酶标仪测定450 nm 处的吸光值，然后计算细胞活性。以此确定下一步槲皮素试验的最佳浓度。

1.2.2抗氧化指标的测定

取密度为5×105个·mL−1细胞接种到六孔板，待细胞贴壁后，去除培养基，PBS清洗后加入DMEM/F12基础培养基(对照组，Con)以及DMEM/F12基础培养基[分别加入1μg·mL−1的LPS(L)、80 μg·mL−1槲皮素(Q)和1 μg·mL−1的LPS + 80 μg·mL−1槲皮素(L + Q)]中，每组5个重复，其中槲皮素用DMSO溶解，每组的DMSO含量为1‰。细胞在37℃、5%CO2培养箱中进行培养6 h，然后收集细胞。根据试剂盒(南京建成生物工程研究所)中的说明书进行总抗氧化力(total antioxidant capacity，T-AOC)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-PX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)等指标的测定。

1.2.3基因相对表达的检测

试验分组和细胞培养方法同1.2.2。试验结束时，去除细胞培养液，然后直接加入1 mL的Trizol，混匀静置5～10 min。RNA 提取参照试剂盒(天根生化科技有限公司)中说明书上的方法进行。RNA 提取后采用One Drop仪器进行总RNA 的浓度和纯度的检测，采用Roche 反转录试剂盒进行cDNA 的合成，然后按照RT-PCR 试剂盒中试验方法进行PCR 反 应 液 的 配 制，在Light Cycler®96 PCR 仪(Roche公司)上进行PCR 检测。操作方法、反应体系和反应液配制参照占今舜等[8]。试验所需引物根据Gene Bank 中的基因序列，由Invitrogen 公司合成。引物序列如表1所列。

表1 引物序列与参数Table 1 Sequencesand detailsof the primersused in thisstudy

1.3 数据处理

试验数据先用Excle 2007进行预处理，基因相对表达量采用2−△△Ct方法进行计算。然后用SPSS 21.0软件进行ANOVA 分析，LSD法进行多重比较，以P<0.01表示差异极显著，P< 0.05表示差异显著。结果用平均值± 标准误表示。

2 结果与分析

2.1 槲皮素对山羊瘤胃上皮细胞活性的影响

添加5～320μg·mL−1槲皮素均能显著增加山羊瘤胃上皮细胞的活性(P<0.05)(图1)。随着槲皮素添加水平的升高，细胞活性呈先增加后下降的趋势，其中80μg·mL−1槲皮素组的细胞活性最高。结果表明，槲皮素能够增加山羊瘤胃上皮细胞的活性。本研究选择浓度为80μg·mL−1槲皮素开展后续试验。

图1 槲皮素对山羊瘤胃上皮细胞相对活性的影响Figure 1 Effects of quercetin on the relative activity of goat rumen epithelial cells

2.2 槲皮素对脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮细胞氧化性能的影响

如表2所列，Q组和L + Q组细胞的T-AOC、GSH-PX 活性极显著高于其他两组(P<0.01)。Con组和L +Q组细胞的CAT活性极显著高于L 组(P<0.01)，Con 组CAT活性极显著低于Q组(P<0.01)，Con 组和L +Q组细胞的SOD活性显著高于L 组(P<0.05)，但极显著低于Q组(P<0.01)。L 组和L +Q组细胞的MDA 含量显著高于其他两组(P<0.05)，Q组最低。结果表明，槲皮素能够增加山羊瘤胃上皮细胞的抗氧化能力。

表2 槲皮素对脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮细胞抗氧化指标的影响Table 2 Effects of quercetin on the antioxidant indices of goat rumen epithelial cellsstimulated by lipopolysaccharide

2.3 槲皮素对脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮细胞因子mRNA 表达的影响

如表3所列，Con 组和Q组细胞CXCL6、CXCL8、IL-6、TNF-α和IL-1β的mRNA 相对表达量极显著低于L 组和L+Q组(P<0.01)，以L 组表达量最高。L组和L +Q组细胞CCL5的mRNA 相对表达量极显著高于Con 组和Q组(P<0.01)，以Q组最低。Q组和L +Q组细胞IK的mRNA 相对表达量极显著低于L 组和Con 组(P<0.01)，以L组表达量最高。以上结果表明，槲皮素具有抑制与炎症相关细胞因子基因的表达。

表3 槲皮素对脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮细胞因子mRNA 表达的影响Table 3 Effect of quercetin on themRNA expression of cytokinesin goat rumen epithelial cells stimulated by lipopolysaccharide

2.4 槲皮素对脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮细胞调控因子mRNA 表达的影响

如表4所列，L组细胞TLR 2和TLR 4的mRNA相对表达量极显著高于Q和L +Q组(P<0.01)，Q和L+Q组之间无显著差异(P>0.05)。L组细胞NF-κB和MyD 88的mRNA 相对表达量极显著高于其他3组(P<0.01)，L +Q组极显著高于其他两组(P<0.01)。L 组细胞TOLLIR的mRNA 相对表达量极显著高于Q和L +Q 组(P<0.01)，但与Con 组无显著差异(P>0.05)。L组细胞IRF3和IFIT 3的mRNA 相对表达量显著高于Q组(P<0.05)，但各处理组细胞UXT的mRNA 相对表达量无显著差异(P>0.05)。以上结果表明，槲皮素能够下调TLR/MyD88/NF-κB 信号通路相关基因的表达。

表4 槲皮素对脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮细胞调控因子mRNA 表达的影响Table4 Effectsof quercetin on the mRNA expression of regulatory factorsin goat rumen epithelial cellsstimulated by lipopolysaccharide

3 讨论

3.1 槲皮素对山羊瘤胃上皮细胞活性的影响

通过体外细胞培养方法研究发现，黄酮类物质如大豆异黄酮、辣木叶黄酮和苜蓿素等均能够增加乳腺上皮细胞的活力和促进细胞增殖[10-12]。结果表明，黄酮类物质能够增加细胞活性，促进细胞增殖。槲皮素是植物中比较常见的黄酮类物质。研究发现，槲皮素能够增加猪小肠上皮细胞和奶牛乳腺上皮细胞的活力，促进细胞增殖[13-14]。本研究也得到相似结果，说明槲皮素有促进山羊瘤胃上皮细胞增殖的作用。

3.2 槲皮素对脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮细胞氧化性能的影响

黄酮类化合物通过释放的氢离子能够与活性氧相结合而直接清除自由基，通过抑制氧化酶的活性和提高防御酶的活性来清除自由基，通过螯合作用、减少金属离子诱导自由基等来发挥抗氧化作用[15]。黄思莹等[16]以桑(Morus alba)叶槲皮素为研究对象，探索其对D-半乳糖衰老小鼠抗氧化能力的研究，结果发现，桑叶槲皮素高剂量组能够提高小鼠血清T-AOC水平、GSH-Px 和SOD的活性，显著降低MDA 含量。杨璐恺等[17]研究发现，在冷冻保护剂中添加槲皮素能够提高羊卵巢组织的CAT 活性。本研究结果与其相似，结果表明，槲皮素能够提高山羊瘤胃上皮细胞的抗氧化能力。LPS是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分，在体内通过细胞信号转导系统激活上皮细胞合成和释放细胞因子和炎性介质，抑制抗氧化酶类的活性，导致脂质氧化，产生活性氧自由基等，进而产生细胞氧化损伤[18]。研究发现，LPS能够降低奶牛乳腺上皮细胞和人肾小球上皮细胞SOD的活性，升高MDA 的含量[19-20]。本研究得到相似的结果，表明LPS能够诱导山羊瘤胃上皮细胞的氧化损伤。在本研究中，LPS刺激下添加槲皮素能够显著提高细胞T-AOC、CAT、SOD和GSH-PX 的活性，结果表明，槲皮素能够提高抗氧化酶类活性来缓解LPS诱导山羊瘤胃上皮细胞的氧化损伤。

3.3 槲皮素对脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮细胞因子基因表达的影响

LPS 是革兰性阴性菌细胞壁成分，当细菌死亡溶解时，其释放出来会诱导细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β)参与炎症反应[21]。帕提古丽[7]研究体外LPS诱导山羊瘤胃上皮细胞损伤，结果发现，LPS显著提高了细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA 表达，本研究结果与其一致。槲皮素、柚皮素、芦丁和苜蓿黄酮等黄酮类物质能够降低单核细胞和奶牛乳腺 上 皮 细 胞 炎 症 因 子TNF-α、IL-6和IL-1β基因的表达[8,22]。本研究得到相似结果，说明槲皮素能够抑制炎症反应。主要组织相容性复合体II(MHCII)抗原大多位于抗原提呈细胞(APC)上，如巨噬细胞等。当细菌侵入组织时，巨噬细胞吞食细菌后，并将细菌碎片利用主要组织相容性复合体(MHC)提示给辅助T 细胞，启动免疫反应。IK 细胞因子能够抑制MHCII抗原的表达和由IFN-γ 诱导的MHC II 抗原的表达[23]。从本研究结果来看，LPS能够促进山羊瘤胃上皮细胞的自身免疫反应，而槲皮素具有抑制细胞自身免疫的作用。趋化因子是一类由细胞分泌，具有诱导附近反应细胞定向趋化能力的细胞因子，分为CXC、CC、CX3C和C4类[24]。CCL5具有调节正常T 细胞表达和分泌的细胞因子，促进炎性细胞因子的释放的作用[25]。CXCL6由巨噬细胞和上皮及间质细胞等分泌，具有趋化粒细胞、促血管生成、抗菌和调节免疫等功能。IL-1β、TNF-α 和LPS均能诱导CXCL6表达，其中IL-1β是CXCL6的主要诱导剂[26]。CXCL8为中性粒细胞趋化因子，它可以诱导靶细胞向感染部位趋化，是一种促炎趋化因子[27]。LPS能够刺激趋化因子的表达，而槲皮素则抑制趋化因子的表达，进而抑制炎症的产生。

3.4 槲皮素对脂多糖刺激下山羊瘤胃上皮细胞调控因子基因表达的影响

Toll 样受体(TLRs)是一类广泛存在于哺乳动物细胞表面的跨膜信号转导蛋白，可以识别病原微生物的蛋白质、核酸、脂类以及代谢产物等物质，激活衔接蛋白，启动下游信号传导通路，诱导细胞产生促炎性细胞因子及趋化因子，产生炎症反应[28]。TLR2和TLR4能识别微生物的脂蛋白和LPS。激活TLRs介导的信号通路需要MyD88、MyD88样衔接蛋白、诱导β干扰素的TIR 结构域衔接蛋白(TRIF)等衔接蛋白的参与。TLR2和TLR4需要MyD88和含TIR结构域的衔接蛋白的共同作用，引起NF-κB活化，诱导IL-1β、IL-6、TNF-α 等炎性细胞因子的分泌和干扰素的表达，参与炎症反应[29]。另外，TLR2和TLR4还可以通过招募TRIF蛋白分子，激活IRF3蛋白分子，继而进入细胞核并诱导一系列相关炎症因子的分泌[30]。IFIT 家族蛋白参与蛋白之间的相互作用，并行使起始翻译、识别双链RNA、参与细胞迁徙及增殖等多种功能。通常该家族分子在大多数细胞中表达量较低，但在LPS刺激可以强烈诱导其表达，其中IFIT3 能够在体内和体外促进IFN 诱导细胞凋亡[31]。从本研究结果来看，槲皮素能够抑制TLR2、TLR4/MyD88/NF-κB信号通路的激活，进而抑制炎性细胞因子的分泌，发挥抗炎症作用。泛表达转录子(UXT)蛋白主要在细胞核，可以与NF-κB形成信号依赖性动态复合体，促进NF-κB增强体形成的核分子伴侣[32]。本研究结果表明，槲皮素不会影响UXT 调控NF-κB 信号通路的功能。

4 结论

槲皮素能够提高山羊瘤胃上皮细胞活性，通过提高抗氧化酶类的活性和调节TLR/MyD88/NF-κB信号通路抑制炎性细胞因子的分泌来缓解LPS诱导的细胞损伤。