植物根际促生菌菌肥在高寒草甸替代化肥效应研究

张万通, 李超群, 于 露, 邵新庆

(中国农业大学草业科学与技术学院， 北京 100193)

青藏高原作为我国重要的生态屏障之一，拥有丰富的高寒草地资源，形成了特有的高寒草甸生态系统[1]。独有的严酷自然地理环境造就了生态系统的极端脆弱性，在区域性和持久性的自然因素和人为因素的干扰下，极易造成草地退化甚至荒漠化，导致高寒草甸生态环境日益恶化[2]。施肥作为退化草地改良和维持天然草地可持续利用的有效手段[3-4]，能增加土壤中营养元素含量，提供植物生长的必需养分，对高寒草地生态系统群落多样性、土壤养分、草地生产力等多方面均能产生影响[5]。

传统意义的施肥虽对农业的发展起到关键作用，但近年来施用化肥的负面效应逐渐显现，如施肥结构不合理、重视氮磷肥却忽视了钾肥的使用；过分注重底肥，施过底肥后不再追肥等均导致了水土失衡、土壤板结等现象[6]。同样在草地施肥中也存在一些问题，如肥料利用率低，无机肥和有机肥不能合理配施，忽视菌肥的使用等，均会造成肥料浪费和土壤营养单一化等问题[7]。

PGPR作为土壤中天然存在的具有生物防治活性的一类细菌，能够间接或直接促进作物生长，主要分布在植物根际(根际土壤、根表面、根内部)[8]。它们定殖在植物根系内与植物形成共生关系，驱动着土壤生态系统中物质循环和能量流动过程，不仅可以合成能够影响植物生长发育的物质(如生长素等植物激素)，活化并增加土壤中有效元素的含量(如氮、磷、钾)[9]促进植物对养分的吸收，亦能减轻或抑制植物病害的发生来促进植物生长[10-11]。研究表明PGPR具有提高宿主植物养分利用率的功能，如生物固氮和有机磷化合物的矿化等[12]。常见的根际促生菌有假单孢菌属(Pseudomonas)、芽孢杆菌属(Bacillus)、农杆菌属(Agrobacterium)、埃文氏菌属(Eriwinia)、黄杆菌属(Flavobacterium)、巴斯德氏菌属(Pasteuria)、沙雷氏菌属(Serratia)、肠杆菌属(Enterobacter)等[13]。PGPR菌肥(或生物菌肥)的研究多集中在对蓝莓(Vacciniumspp.)、马铃薯(SolanumtuberosumL.)等经济作物以及羊草(Leymuschinensis)、紫花苜蓿(MedicagosativaL.)等牧草的影响[14-17]，然而对草地生态系统(群落)的相关研究较少。

目前研究表明PGPR生物菌肥配施部分化肥，可在数量和性能上与化肥很好地相互补充，在农业生产中减少无机化肥的过度使用，以此达到绿色生产、保障食品安全的目的[18]。因此，为了减少青藏高原高寒草甸化肥的使用，以及降低化肥对青藏高原高寒草甸的污染程度，本试验拟施用不同剂量的化肥和PGPR菌肥，开展地上植被和土壤理化性质的研究，以期了解PGPR菌肥替代部分化肥的可能性，为高寒气候条件下肥料的合理使用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

不同禾本科植物根际筛选获得的供试PGPR复合菌肥，其主要成分为高效溶磷菌(Bacillussp.)、联合固氮菌株(Azospirillussp.)、分泌植物激素菌(Azospirillussp.)和生防菌株(Bacillussp.)(专利号ZL 2010 10557699.3)，由甘肃农业大学草业学院提供。有机肥来自于试验园区，主要成分为腐熟羊粪(有机质32.39%，氮约为1.63%，磷(P2O5)1.54%，钾(K2O)0.085%)；磷肥主要成分为过磷酸钙(14% P2O5)，来源于云南省昆明市海口宏宝磷肥厂；氮肥主要为尿素(N 46%)，由青海云天化国际化肥有限公司提供；氮磷肥则为磷酸氢二铵(N 18%，P2O546%)，由湖北大峪口化工有限责任公司提供。

1.2 试验设计

试验地位于青海省海北州海晏县高原现代生态畜牧试验示范园牧草种植试验区(100°23'～101°20'E，36°44'～37°39'N)。属高原亚干旱气候，年平均气温1.5℃左右，年日照时数大约在2 980 h，年降水量大约400 mm，无绝对无霜期。主要植被类型有高寒草甸、高寒草原、高寒流石坡稀疏植被。选取植被类型相对一致的两块样地，分别施用化肥和PGPR菌肥。同时对试验地进行围栏处理，化肥、有机肥和菌肥试验均采取随机区组设计。小区设计如下：每个小区面积为10 m×6 m，各小区间隔1 m，区间不施肥[19]。于2014年7月和2015年6月2次将肥料施在试验小区，其中PGPR菌肥施用是用一定量的土和菌肥混合均匀，开沟条施于行间，深度3～5 cm，且施后立即覆土。2块样地施肥后不采取任何人工措施，让其自然生长，每个处理设置5个重复。试验中各处理肥料施用量详见表1。

表1 化肥施用量

1.3 测定指标及方法

1.3.1植物群落调查 在2015年8月12日调查群落结构及物种组成，此时植物群落生物量达到高峰期，便于区分鉴别植物物种。在每个小区内选取一个50 cm×50 cm的样方，以调查样方内的植物群落特征，即物种的数量、密度、总盖度、植物高度等。Margalef丰富度指数(Ma)、Shannon-Wiener多样性指数(H＇)衡量地上植物群落的多样性，Pielou均匀度指数(J)来表示植物群落的均一性。植被调查结束后，齐地面刈割样方内所有的植物，装在纸信封后带回实验室于65℃的烘箱中烘至恒重，称重计算地上生物量。

1.3.2土壤理化性质 在每个小区用直径5 cm×5 cm土钻随机取地表0～20 cm的土壤，按之字形进行5次重复取样，将其混匀后作为该小区的一个样品，过2 mm筛挑出植物残体和碎石块。然后将每份样品分为2份：一份自然风干，用来分析土壤理化性质；另一份放在装有冰块的保温箱内，尽快带回实验室，采用烘干称重法测定土壤含水量；用pH计和电导率仪分别测定土壤pH和电导率EC。土壤全氮、全磷、有机碳分别用凯式定氮法、钼锑抗比色法测定、浓硫酸-重铬酸钾稀释热法测定，土壤无机氮测定采用流动分析仪分析[20]。

1.4 数据分析与处理

物种多样性选用Shannon-wiener多样性指数(H＇)、Pielou均匀度指数(J)和Margalef丰富度指数(Ma)等进行测量。

(1)

Pielou均匀度指数：J=H＇/lnS

(2)

Margalef丰富度指数：Ma=(S-1)/lnN

(3)

式中：Pi为物种i在群落中的重要值，即(相对密度+相对高度+相对生物量)/3；S为物种数；N为样方中总物种个体数。

用Microsoft Excel2010整理、计算数据并用origin作图，对不同施肥处理下地上生物量、Shannon-wiener多样性指数、Pielou均匀度指数、Margalef物种丰富度指数、土壤水分、土壤pH值、土壤电导率、土壤全氮、土壤全磷、土壤有机碳、土壤铵态氮、土壤硝态氮含量进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，使用LSD法进行多重比较，显著性水平为P<0.05。以上所有数据用SPSS 17.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同施肥处理对植物群落特征的影响

2.1.1不同施肥处理对地上生物量的影响 NP处理较CK处理显著增加地上生物量，增幅为72.19%(图1)。N处理、O处理、J1+N处理和J1处理分别使地上生物量平均增加28.9%，4.05%，20.54%，6.69%，但无显著性差异。P处理、J1+P处理、J3处理与CK 267.49 g·m-2相比，分别使地上生物量下降至254.25 g·m-2，238.42 g·m-2，260.71 g·m-2，且差异不显著。

图1 不同施肥处理下地上生物量情况

2.1.2不同施肥处理对物种多样性的影响 CK处理的物种丰富度为17.0，其它施肥处理与CK相比均降低了物种丰富度，NP处理下降至13.20，降幅约为22.35%，差异显著(P<0.05)；J1+N处理和J2处理效果相同，均使物种丰富度下降至15，但处理间差异不显著。不同施肥处理均导致Shannon-wiener多样性指数呈现下降趋势，NP处理和J1+N处理分别下降至2.33和2.38，仅O处理下降最少为2.4。Pielou均匀度指数在不同施肥处理下都不显著。其中NP，J1与CK处理相比分别增加了0.03和0.01，达到0.91和0.89，而P处理和J3处理下降至0.86和0.87(表2)。

表2 不同施肥处理下物种多样性变化

2.2 不同施肥处理对土壤物理性质的影响

2.2.1不同施肥处理对土壤水分、电导率的影响 与CK相比(图2A)，J1和J3处理的土壤水分显著降低，分别为30.74%和22.62%(P<0.05)。J1+N和J2增加了土壤水分，增幅分别为4.92%和0.86%。各施肥处理之间土壤电导率总体无显著差异(图2B)，与CK相比N处理显著增加了电导率(P<0.05)，达到304.16 μs·cm-3。

图2 不同施肥处理下土壤水分和电导率变化

2.2.2不同施肥处理对土壤pH的影响 各施肥处理对土壤pH值影响不同，均呈现碱性(图3)。与CK相比，处理N和NP显著降低(P<0.05)，O处理、J1处理、J3处理增加了土壤pH值，各处理间无显著差异。

图3 不同施肥处理下土壤pH情况

2.3 不同施肥处理对土壤化学性质的影响

2.3.1不同施肥处理对土壤全氮、全磷的影响 与CK(含量1.58 g·kg-1)相比，除N处理和P处理外，其他处理中全氮含量都有所上升，其中J1+N全氮含量增加最多，达到2.77 g·kg-1，差异显著(P<0.05)。菌肥施用的J1，J2，J3处理下全氮含量分别为2.64 g·kg-1，2.65 g·kg-1，2.44 g·kg-1(图4A)。全磷测定显示，CK全磷含量为0.61 g·kg-1，与其它处理相比只有NP处理显著提高了土壤全磷含量(P<0.05)，达到0.68 g·kg-1。P处理、O处理和J1处理提高了全磷含量，N处理、J1+N处理、J1+P处理、J2处理和J3处理使全磷含量下降，处于0.56～0.60 g·kg-1(图4B)。

2.3.2不同施肥处理对土壤铵态氮、硝态氮的影响 各施肥处理和CK相比，均增加了土壤铵态氮的含量(图5)，其中N处理、NP处理、O处理与CK相比差异显著(P<0.05)，含量分别为11.11 mg·kg-1，8.19 mg·kg-1，8.86 mg·kg-1，而各菌肥施加处理之间差异不显著。与CK的硝态氮含量19.34 mg·kg-1相比，只有N处理显著增加，达到51.58 mg·kg-1(P<0.05)。P处理和O处理对土壤硝态氮含量起到增加的作用，增幅分别约为7.17%和24.03%，但NP处理、J1+N处理、J1+P处理、J1处理和J2处理降低了土壤硝态氮含量，分别是14.08 mg·kg-1，17.76 mg·kg-1，15.39 mg·kg-1，17.37 mg·kg-1和16.71 mg·kg-1，但各处理间无显著差异。

图5 不同施肥处理下土壤铵态氮和硝态氮变化

2.3.3不同施肥处理对土壤有机碳的影响 与CK(有机碳含量37.39 g·kg-1)相比(图6)，只有J3处理增加了土壤有机碳的含量，达到50.69 g·kg-1，且与N处理和NP处理相比，J3增加了土壤有机碳含量，但不显著。J2处理含量最低，为29.70 g·kg-1，各处理之间差异不显著。

图6 不同施肥处理下土壤有机碳情况

3 讨论

3.1 不同施肥处理对植物群落特征的影响

在草地生态系统中，施肥通常会导致生物量增加和生物多样性下降[21]。Kirchner等[22]研究发现，施肥显著提高草地群落生产力，但物种多样性有所下降；张春花[23]研究发现施肥显著降低物种丰富度的同时增加了群落生物量。本研究结果中N处理、J1+N处理都增加了地上植被生产力，以NP处理效果最为显著(P<0.05)。这是由于氮磷肥可快速有效地增加质地贫瘠土壤的速效养分，改良土壤营养状况，为植物提供营养物质，同时也促进植被对水的利用效率，从而显著提高草地生产力[24]。但当菌肥配施氮肥(J1+N)使用时，与CK相比其地上生物量虽无显著差异，但有一定的增加趋势，J1+N具有一定的促生作用，但效果不及氮磷复合肥，这可能与不同肥料和施用量的作用以及不同植物类群对施肥的响应差异有关[25]，也可能是施肥年限过短造成地上生物量响应不显著。本研究中施用全量菌肥(J2，J3)后，地上生物量和CK相比呈下降趋势，这说明在目前农业生产水平下，全量菌肥未必起到明显效果，但微生物肥料与化肥合理配施对高寒草地生物量增加有较好效果[26]，同时说明微生物肥料只能部分替代化学肥料。因群落植物物种丰富度和多样性指数的变化除与植被本身特性有关外，草原土壤基质的改良程度、种间(内)竞争也会对其产生一定程度的影响[27]，施肥提高了土壤养分的可利用性，使得植物之间的竞争由地下转为地上部分，这也解释了本结果中PGPR菌肥配施化肥的试验处理(J1+N，J1+P)下与无机化肥处理(N，NP)其变化趋势相似，即物种丰富度下降，但J1+N比无机肥下降幅度小，这一结果与Ren[28]、张杰琦等人[29]研究相近，说明因施加微生物肥料的种类不同，草地优势种生长能力显著提高，占据群落中的主导地位，在这一过程中其他不同种植物的地位也产生相应变化，群落结构趋于简单化，物种多样性有所减少[16]。陈奇乐[30]对河北坝上典型退化草地施用无机肥料发现植被Shannon-Wiener多样性指数和Pielo均匀度指数随施肥量的增加呈现减小趋势，本研究与其发现较为一致，但均匀度指数变化没有规律。可能是与施肥试验的时间太短有关，由施肥引起的竞争导致群落中物种迁移过程需要较长的时间，施肥年限较短不足以发生物种水平上的演替，但是竞争会引起各物种的个体数量或密度发生变化[31]。

3.2 不同施肥处理对土壤理化性质的影响

土壤水分不仅影响土壤的物理性质，也制约着土壤中养分的溶解、转移和微生物的活动，是构成土壤肥力的一个重要因素。本研究发现施用不同类型的肥料对土壤水分有一定的影响，但差异不显著。与不施肥相比，J1+N和J2处理增加了土壤水分，这与徐畅在马铃薯(SolanumtuberosumL.)施加微生物肥料后，根际土壤含水量增加结果相似[15]，而J1和J3处理则使得土壤水分显著下降，这说明PGPR菌肥施用的浓度不同使土壤微生物数量增加，加剧微生物消耗土壤含水量的速率，造成土壤水分大幅度下降[32]。

土壤pH值和电导率作为影响植物的生长发育主要因素之一，能够综合评估土壤营养离子情况[33]。陈奇乐[30]通过对坝上草地短期施肥发现，施加氮肥有利于降低土壤pH值，本研究结果与之一致。其原因在于施肥过程中过量的氮素增强了植物根系对于土壤中阳离子的吸收能力，使H+大量排出，出现土壤pH值下降现象，对生态系统产生如土壤酸化、盐基离子流失等一定的负面影响[34]。J1+N并没有使土壤pH值下降，但J3处理与之相反，这可能与微生物自身代谢有关，因其对土壤难溶养分和有机质有较强的分解和转化能力，在施用菌肥的情况下进一步促进了养分循环和植物生长的同时，也提高了植物生存的土壤微环境肥力[14]。以上表明菌肥+化肥可以减少无机化肥的施用，且可以缓解土壤盐渍化。

施肥也会改变土壤的化学性质，影响植物吸收营养元素[35]。李恩宇等[36]研究发现施肥处理对高寒草甸5月和7月份土壤全氮含量均无显著影响，但土壤速效氮和速效磷含量在7月份最高。本研究表明施加无机化肥(N，NP)可以显著增加土壤铵态氮和硝态氮含量(0～20 cm)，但是没有影响全氮含量，总结其原因为高寒草原无机施肥影响了土壤微生物的活性，加速了其对土壤全氮的分解[29]，也可能是因为植物在氮磷等营养元素的作用下快速生长，加速了对土壤中氮营养元素消耗速度[37]。各菌肥处理增加了土壤全氮的含量，其中J1+N处理显著提高了土壤全氮含量，但没有提高速效氮含量，说明高浓度的化肥抑制了活菌的活动，或者是PGPR菌肥中的微生物需要对土壤环境有一定的适应过程[38]。研究表明植物对磷吸收能力的大小与土壤理化性质，即含磷水平也密切相关[39]。本研究发现除NP处理外，其它处理对土壤全磷含量均没有显著差异，这与陈桂芬[40]、Krey等[12]结果一致，说明除PGPR细菌自身对磷的需求和本地微生物的竞争增强外，植物对磷的吸收也随着施用有机肥逐渐增强[12]。

适宜的有机碳含量是土壤提供最佳的植物生长条件、养分循环以及有效水分渗入和存储的重要前提条件[41]。本试验的P处理和J3菌肥处理增加了有机碳含量，其余处理使得土壤有机碳含量下降。这与Warembourg等人研究相近，归结其原因主要有:一方面，施用有机肥更有助于土壤有机碳和无机碳库的积累[42]，土壤可利用氮含量增加，有利于地上植被生长，产生更多的地上凋落物，使得土壤有机质增加；另一方面，由于短期施肥后土壤中碳输入变多，使得微生物活性增加和碳损变大[43]，导致其处理下土壤有机质下降。因此施肥能够引起土壤有机质发生增加或减少两种截然不同变化趋势，但施肥含量配比对土壤有机质的变化需要进一步探究。

4 结论

不同施肥处理下，PGPR菌肥+70%氮肥不仅没有减少地上生物量，还可以缓解因施氮肥引起的物种丰富度下降。同时PGPR菌肥+70%氮肥处理增加土壤含水量，并未影响土壤pH值；相较于施氮肥处理，PGPR菌肥+70%氮肥处理提高土壤全氮量，但未增加速效氮和全磷含量。综上所述，PGPR菌肥并不能完全替代化肥，但在一定程度上菌肥配施无机肥优于单施肥(全量菌肥)效果，其中PGPR菌肥+70%氮肥处理效果最好，能达到促进植物生长和保护生态环境的目的。目前国内外对于PGPR菌肥在田间的应用效果方面仍存在着较大差异。因此，有关其他因素对PGPR菌肥应用效果的影响，还需进一步的研究。