野豌豆属种子形态多样性与种子分类鉴定方法的研究

2021-08-03刘博文黎桂阳常媛飞金美燕刘芳高秋刘万良哈斯塔米尔王显国

草地学报 2021年7期

刘博文，黎桂阳，常媛飞，金美燕，刘芳，高秋，刘万良，哈斯塔米尔，王显国*

(1. 中国农业大学草业科学与技术学院，北京 100193； 2. 河南省绿色工程有限公司, 河南郑州 450000； 3. 全国畜牧总站，北京 100125； 4. 乌兰浩特市林业和草原局草原工作站，内蒙古乌兰浩特 137400； 5. 阿鲁科尔沁旗绍根镇人民政府，内蒙古赤峰 025567)

野豌豆属(ViciaL.)属于豆科(Leguminosae)蝶形花亚科(Papilionatae)野豌豆族(Viciae)一、二年生或多年生草本。本属植物约有180～210种，主要分布在欧洲、高加索和中国[1-4]。农业上该属植物主要作为牧草和绿肥以及冬季覆盖作物，此外也可食用或作为观赏作物和药用植物[5-10]。救荒野豌豆(ViciasativaL.),毛苕子(ViciavillosaRoth),光叶紫花苕(ViciavillosaRoth var.)等栽培驯化种均被世界各国广为栽培[11-13]，以山野豌豆(ViciaamoenaFisch. ex DC.)为代表的众多野生种类多为我国天然草地重要组成物种，饲用价值高、抗逆性强[11,14]，且饲草品质可以与苜蓿(MedicagoSativaLinn)相媲美，极具栽培驯化潜力[15-16]。然而大部分野豌豆属植物尚未驯化，而对野豌豆属植物的开发与利用离不开对其遗传多样性与分类鉴定的研究。

由于野豌豆属植物的植株形态变异幅度难以掌握，不同学者在其属下分类、种间和种下分类的处理上大有不同。1976年Kupicha[17]第一次提出将野豌豆属分为Vicilla和Vicia两个亚属，并分别分为17和5个组；Maxted[18]又将Vicia亚属分成9个组，38个物种、14个亚种和22个变种，后有研究认为Vicilla亚属应改为Cracca[19-20]；夏振岱[21]在1996年的研究中表明我国共43种，4变种和6变型，并整理为6个组；刘云波和赵一之[1]将Cracca组和Cassubicae组合并为Cracca组；贺蓉等[22]将硬毛果野豌豆(Viciahirsuta(L.) S. F. Gray)归于Cracca组；《中国植物志》中将四籽野豌豆(Viciatetrasperma(L.) Schreber)，组中的小巢菜(Viciahirsuta(L.) S. F. Gray)单独归为硬毛果野豌豆组，在2019年将原来单独为一个种的窄叶野豌豆改为救荒野豌豆的亚种。可见野豌豆属的分类处理结果在不同学者间尚不一致，因此有必要对野豌豆属植物进行进一步的鉴定并分类，以利于野豌豆属植物的利用。

形态学研究是种质资源的鉴定、评价和多样性研究中最为简单、表现直观、经济节约的方法。种子形态特征经常作为研究对象用以区分种类。种子生长环境与其他营养器官相比较为封闭，受到的外界环境因子的影响较小。因此，种子形态特征相对稳定，其在分类学上有重要意义[27-32]。野豌豆属种子，从蚕豆(ViciafabaL.)到四籽野豌豆大小差异较大，种皮颜色各不相同，都可作为种间分类依据[23-24]。Buykka等[25]发现救荒野豌豆硬籽品种的种子较软籽品种的种子小。Ann[26]对野豌豆不同种类的种胚进行观察研究，表明子叶的形状和颜色，胚根的形状、颜色和位置，胚芽的颜色等形态特征变异丰富并且可作为野豌豆属的分类的辅助特征。

为了促进野豌豆属植物的开发利用，进一步完善野豌豆属植物的分类鉴定，本研究通过对14种的48份野豌豆属材料的种子形态的多样性进行分析，旨在揭示野豌豆属形态水平的遗传多样性，并确定可作为野豌豆属分类鉴定的种子形态特征的指标，探讨其系统分类，为野豌豆属物种鉴定和分类提供形态学的依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料均来自于全国畜牧总站草种质资源库(表1)。

表1 供试材料名称与来源

续表1

1.2 试验方法

参照种子形态性状的规范和描述选择17个种子性状[33-37]。种子长、种子宽、种脐长测量方法如图1所示。选择相对均匀的种子每份材料10粒，剥去种皮，在解剖镜下观察其胚根颜色和形状等并拍照，然后用image J软件对胚根的长度(从胚根的基部到尖端的距离)和宽度(胚根基部宽度)进行统计[26]，具体测定及赋值方法见表2。

图1 种子长、种子宽、种脐长、胚根长和胚根宽的测量示意图

表2 野豌豆属种子表型性状测量指标

1.3 数据处理与统计分析

用Excel表格进行数据统计，利用SPSS 25软件分析各性状平均值(X)、标准差(S)、变异系数(CV)等。

式中X为测定指标具体数值，N为重复数。

H′=-∑Pi×LnPi

式中Pi为性状第i级别内材料份数占总份数的百分比，Xi为第i级中的数据。

相关性分析和主成分分析用SPSS 25软件进行。聚类分析采用软件为NTSYSpc2.10，用其中UPGMA方法(Unweighted Pairgroup Method Arithmetic Averages不加权成组算术平均数法) 进行聚类分析，并通过Tree plot模块生成聚类图(phenogram)[39]。

2 结果与分析

2.1 野豌豆属种子形态特征分析

2.1.1数量性状 10个数量性状统计结果见表3。结果显示：不同材料百粒重之间存在显著差异(P<0.05)，最大为13.62 g，最小为0.36 g；种子长、种子宽和种子厚最大的均为法国野豌豆(48)，最小的为四籽野豌豆(41)，这与百粒重的结果相同；种形指数在0.83～1.21之间，说明野豌豆属种子基本上处于椭圆形到球形之间；种脐长度在1.36 mm～4.39 mm之间，脐长/种子长的比值在38%～100%之间；胚根长在0.61～2.46 mm之间，胚根宽在0.46～1.73 mm之间，胚根宽/胚根长在34%～168%之间。

表3 野豌豆种子数量性状的变异分析及遗传多样性分析

2.1.2质量性状 7个质量性状分析结果见表4。结果表明：种皮颜色依次分为黄色、黄褐色、红褐色、棕色、灰色和黑色；根据种子颜色是否含有杂色，分为有无纹理，多数野豌豆种子种皮有纹理；种脐形状由线形到棒状，种脐颜色根据材料分为7个不同颜色，胚根尖端的形状分别呈现出锐尖、渐尖和钝，胚根基部呈现有斑纹和无斑纹两种类型；子叶颜色主要为黄色，并细分为浅黄色、黄色和橘黄色。

表4 野豌豆属种子质量性状的变异分析及遗传多样性分析

2.1.3野豌豆属种子形态变异分析变异系数和Shannon多样性信息指数都是反映种质资源多样性的指标，变异系数表示某一种表型性状的变异范畴，Shannon多样性信息指数表示种质资源不同表型性状的分级和数量的分布情况。

48份野豌豆17个种子表型性状的平均变异系数为36.05%，百粒重最大，为81.92%，种形指数最小，为6.85%；种皮颜色、种脐颜色和百粒重变异系数均超过60%，其他指标变异系数均在20%～40%之间。Shannon多样性信息指数的平均值为1.42。数量性状多样性信息指数最大为种形指数(1.94)，最小为百粒重(1.58)；质量性状多样性信息指数最大为种脐颜色(1.56)，最小为种皮纹理(0.51)。结果表明我国野豌豆属种间各形态指标在统计学上差异显著，变异丰富，可依据种间变异较大的指标来对野豌豆植物进行准确分类。

2.2 48份野豌豆属植物种子的17个形态性状的主成分分析

主成分分析可以详细地了解野豌豆属不同种间存在差异的主要原因。主成分分析结果如表5所示，以特征值大于1为标准提取主成分，前6个主成分累计贡献率为86.09%。第一主成分的贡献率为37.39%，其中载荷最大为种子宽，其次是胚根长、百粒重、种子长、种子厚、种脐形状，载荷均超过0.80。第二主成分的贡献率为17.08%，载荷最大为种脐长，其次是种皮颜色、种脐长/种子长、胚根宽和种形指数。第三主成分的贡献率为10.83%，其中载荷最大为种皮纹理，其次是种脐颜色和种皮颜色。第四主成分累计贡献率为8.16%，载荷最大为胚根宽，其次是胚根宽/胚根长和子叶颜色。第五主成分累计贡献率为6.64%，载荷最大为胚根尖端，其次是种形指数。第六主成分累计贡献率为6.00%，载荷最大为子叶颜色。六个主成分中，载荷较大的指标在一定程度上可表明各种间存在差异的原因，即供试的14个种间差异是由于上述指标间的变异而形成的。

表5 野豌豆属种子形态指标的主成分载荷矩阵和累积贡献率

2.3 数量性状的相关性分析

对48份野豌豆属材料种子的10个数量性状进行相关性分析(表6)。结果表明种子各性状间表现出复杂的相关性。代表种子大小的性状种子长、种子宽、种子厚和百粒重相互之间呈极显著正相关关系(P<0.01)，这些性状与胚根长也呈极显著正相关关系(P<0.05)，说明种子越大，胚根长度越长。种脐长与百粒重、种子宽、种形指数呈显著正相关关系(P<0.05)，与种子长、种子厚呈极显著正相关关系(P<0.01)。脐长/种子长与种子长、种子宽、百粒重和种子厚均呈极显著负相关关系(P<0.01)。胚根宽与种子长、种子宽呈极显著正相关关系(P<0.01)，与种子厚和种脐长呈显著正相关关系(P<0.05)。胚根宽/胚根长与种子长、种子宽、百粒重和胚根长均呈极显著负相关关系(P<0.01)，与种子厚呈显著负相关关系(P<0.05)，与脐长/种子长和胚根宽呈极显著正相关关系(P<0.01)。根据各指标间的相关关系，可依据其中任一指标来确定其他指标的性状表现，为种间鉴定性状的选择提供依据。

表6 野豌豆属种子数量性状间的相关关系

2.4 48份野豌豆属植物种子的聚类分析

根据种子形态性状对本次供试的48份野豌豆属材料进行聚类分析，结果表明在相似性系数为0.790的时候可以分为5大类群(图2所示)。第一类群共13份材料，分为两个亚类，第一亚类包括1份窄叶野豌豆(14)，1份救荒野豌豆(1)和1份法国野豌豆(48)，第二亚类包括10份救荒野豌豆(2，4，5，10，8，3，9，7，11，6)。第二类群共4份材料包括1份窄叶野豌豆(13)和3份野豌豆(21，22，23)。第三类群共6份材料，分为两个亚类，第一亚类包括1份窄叶野豌豆(12)和1份长柔毛野豌豆(17)，第二亚类包括4份长柔毛野豌豆(16，18，19，20)。第四类群包括17份材料，分为两个亚类，第一亚类包括3份广布野豌豆(24，25，26)，2份大花野豌豆(27，28)，1份长柔毛野豌豆(15)和3份歪头菜(42，43，44)，第二亚类包括2份大叶野豌豆(32，33)，3份山野豌豆(37，38，39)和3份黑龙江野豌豆(34，35，36)。第五类群共8份材料，分为三个亚类，第一亚类为3份大野豌豆(29，30，31)，第二亚类为2份四籽野豌豆(40，41)，第三亚类为3份小巢菜(45，46，47)。

图2 48份材料种子形态聚类结果图

3 讨论

种子作为植物重要的繁殖器官，其形态特征对于植物分类的重要性很早就被植物学家所认识[40]。对种子微观形态的研究，可以为植物属和种的系统划分提供科学的理论依据[41]，并揭示植物属间或种间遗传特征[42]。段朋娜[43]研究表明，爵床科(Acanthaceae)种子形态具有种间特异性，种子大小在爵床科种间分类上具有重要意义。刘洋等[44]的研究也表明，从小粒野生大豆到大粒半野生大豆(Glycinemax(Linn.) Merr.)各类型的遗传分化与它们的百粒重大小有密切关联。百粒重大小可以作为评价野生大豆物种内的遗传分化或进化程度的主要指标之一有其遗传上的理论依据。Salimpour等[45]探究三叶草(TrifoliumpratenseL)的种子形态特征得出，种子形态、大小是Lotoidea地区三叶草重要的分类特征。本研究通过对野豌豆属种子形态特征进行分析，发现种形指数在0.83～1.21之间，变异系数仅6.85%，该属种子基本处于椭圆形到球形之间，种间差异小，具有一致性，供试材料不能依据种形进行分类鉴定。但表示种子大小的种子长、种子宽、种子厚和百粒重等指标均表现出丰富的变异，可依据相关指标对不同种进行鉴定分类。

种子颜色在多种植物中都已作为重要的分类指标[46-47]。本研究种子种皮颜色有黄色、黄褐色、红褐色、灰色和黑色5种颜色，变异系数较高，达到64.30，Shannon多样性信息指数1.48。而Hosseinzadeh[48]将野豌豆属种子的种皮颜色分为底色和斑纹色，其中底色有浅棕色、绿色和奶油色，斑纹颜色为深棕色、黑棕色、棕色和黑色。本研究野豌豆属种子的种皮颜色之所以与Hosseinzadeh研究结果表现出不同，与植物所处的海拔，栖息地，植物高度以及其系统发育有关[49-50]。正因为同种植物由于生境不同造成不同学者之间研究的差异，对国内野豌豆属植物的分类鉴定是十分必要的。本研究中广布野豌豆种皮颜色为褐色，这与胡振天等[51]研究野生广布野豌豆种皮颜色黑褐色相近。彭艳等[52]在对我国西藏野豌豆种质资源研究中发现山野豌豆表皮为深褐色或黑褐色。本研究中山野豌豆种皮颜色为黑色，可见山野豌豆表皮为褐色或黑色，为该种种子的特征之一。供试材料中长柔毛野豌豆、四籽野豌豆和法国野豌豆种皮颜色一致，无杂色，其他材料均有纹理，种皮纹理可在一定范围内区分供试材料。Marin等[53]对种皮纹饰的研究发现大部分野豌豆属的种子表现出特属的乳突模式，从微观形态角度将长柔毛、四籽野豌豆和法国野豌豆与其他野豌豆属植物区分。因此颜色及纹理也可以为野豌豆属分类鉴定提供依据。

种脐的形态特征也可作为种间分类依据[54]。Hosseinzade等[55]结合种脐颜色和形状对伊朗野豌豆属植物进行区分。本研究中种脐颜色变异系数达到75.12，种脐形状变异系数次之，为35.58，种脐长变异系数最低，为28.78，种脐颜色和种脐长也表现出较高的多样性，在本研究中均作为野豌豆属分类鉴定的依据。马正华等[23]的研究表明救荒野豌豆种脐颜色与本研究结果分类标准相同，窄叶野豌豆种脐同样为白色。

胚根由于有种皮包裹，受外界环境变化的影响较小，更能反应出种质资源之间的变异。唐赛春等[56]、Hu等[57]分别强调了胚根特征在竹类植物中的分类意义。胚根长、胚根宽变异系数较高，可用于区分不同种的种子，而胚根基部斑纹、胚根尖端形状变异较少，多样性小，但在本研究中仍可在一定程度上用于分类鉴定。此外子叶颜色变异系数相对较小，但仍可代表部分种子特征。夏碧波等[58]研究中，子叶颜色虽然变异系数较低，但仍是引进辣椒(Capsicumannuum)资源聚类分析的重要依据。

主成分分析结果表明，所测定17个形态指标中，百粒重、种子长、种子宽、种子厚、胚根长、种脐形状、胚根尖端形状为主要成分，能够代表所测的17个性状的绝大多数信息，表明野豌豆属种子表型遗传变异主要来自于上述性状。杨晓霞[59]对暴马丁香(Syringareticulata(Bl.)Hara var.Mandshurica(Maxim.) Hara (S.AmurensisRupr.)种子形态指标进行主成分分析也表明，百粒重、种子长、种子宽均是主要形态特征。同时种脐长、种皮颜色、种脐长/种子长、胚根宽、子叶颜色等载荷也较高。张建茹[60]在研究小檗科(Berberidaceae Juss.)植物种子微观形态及其分类学意义中表明，种子形状和种皮纹饰的负荷量绝对值在0.7以上，具有重要分类意义。因此，本研究通过主成分分析，了解各性状对目标性状作用的大小，也充分说明上述指标是区分不同野豌豆属不同种的重要依据。

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相关性分析表明反映种子大小的性状百粒重、种子长、种子宽和种子厚相互之间有极显著的正相关关系(P<0.01)，这与胡凌峰对花榈木(0rmosiahenryiPrain)[61]种子的研究结果一致。当对其中某一性状进行选择时，其他性状也会随着发生变化。因此在反映种子大小的性状中选择其一即可用于鉴定，而百粒重变异范围大，多样性指数高，可作为种间分类的重要指标之一。百粒重与种脐长存在显著正相关关系(P<0.05)。陈秀萍等[62]对龙眼(DimocarpuslonganLour.)种质资源种子形状多样性的调查中也得出种脐长和单果重呈显著正相关关系，这与本次试验结果相似。种脐长与种子长之间存在正相关关系，种子长度的增加，种脐长度随之增加。种脐长/种子长尽管有变化，但在种内具有很高的稳定性，可以作为鉴别特征之一[36]。本研究也表明种脐长与种子长呈极显著正相关关系(P<0.01)，相关系数为0.454，且该指标在种间具有较大变异，多样性指数较高，是重要的鉴别特征之一。

聚类分析可以用来综合研究不同物种及其样本之间的性状类型分类，能较好地反映种质材料之间的亲缘关系。本研究中，部分窄叶野豌豆材料和长柔毛野豌豆为一大类，同时有窄叶野豌豆与救荒野豌豆、法国野豌豆为一大类，窄叶野豌豆也与野豌豆为一大类，四籽野豌豆和小巢菜为一大类，广布野豌豆、大花野豌豆、大叶野豌豆、黑龙江野豌豆、歪头菜聚为一大类。Wouw等[63]结果显示救荒野豌豆与窄叶野豌豆在一个大类，Seahee等[64]关于野豌豆属种子形态和微观形态性状的种间变异的研究中对野豌豆属植物的分类与本研究分类相同。Castiglione等[65]的研究表明野豌豆和救荒野豌豆与蚕豆分为两大类，但野豌豆与救荒野豌豆又分属两个亚类。本研究结果也表明，救荒野豌豆与野豌豆在不同大类中。

但在Seahee的研究中，山野豌豆与黑龙江野豌豆、大叶野豌豆分为不同组，四籽野豌豆和救荒野豌豆、野豌豆、法国野豌豆、长柔毛野豌都聚为一大类，与本研究不同。由于本研究收集的材料均在国内，而植物生境会造成种间变异[66-68]，因此造成分类上的差异。贾文秀[16]对山野豌豆种子生物学特性中指出不同生境下山野豌豆种子千粒重不同，生于低山丘陵地的山野豌豆千粒重较大。而本研究中的窄叶野豌豆、长柔毛野豌豆由于生境不同导致种间变异，使其形态特征的变化而归于不同大类，还需进一部进行分类鉴定。本研究第四大类的分类与《中国植物志》中大叶野豌豆组分类相同。同时大花野豌豆、广布野豌豆、歪头菜和1份长柔毛野豌豆也都在这一大类中。但本研究大野豌豆不在大叶野豌豆组，而是和四籽野豌豆一组。小巢菜在《中国植物志》中属于硬毛果野豌豆组，大花野豌豆属于四籽野豌豆组，本研究则将小巢菜与四籽野豌豆归于一组，大花野豌豆归于大叶野豌豆组。

4 结论

48份野豌豆种子形态性状表现出丰富的多样性。形态性状的平均变异系数为36.05%，百粒重最大，为81.92%；Shannon多样性信息的平均值为1.82，种形指数最大，为1.94。种子长、种子宽、种子厚和百粒重相互之间呈极显著正相关关系(P<0.01)，它们与胚根长和种脐长也呈正相关关系。相似性系数为0.79时，供试材料分为5大类群。以特征值大于1为标准提取主成分，前6个主成分累计贡献率为86.09%。种脐形状、种脐颜色、百粒重、种皮颜色、脐长/种子长和胚根基部斑纹可作为野豌豆属种子的分类鉴定依据。

根据研究结果，依据百粒重、种脐颜色、种皮颜色、种皮纹理、种脐长/种子长、子叶颜色、胚根基部斑纹、种脐形状、胚根宽/胚根长为该14种野豌豆属植物鉴定指标制作检索表，如下：

1a.种脐线形，种脐白色

2a.百粒重大于13.0 g，种皮红褐色无斑纹，种脐长与种子长之比小于0.5

法国野豌豆

2b.百粒重小于13.0 g

3a.百粒重大于5.0 g，子叶颜色有橘黄色、浅黄色和米黄色，种脐长与种子长之比在0.5左右，胚根基部无黑色斑

救荒野豌豆

4a.胚根宽与胚根长之比大于0.9，子叶米黄色。种皮黄色有黑色花纹，胚根基部无斑纹

野豌豆

4b.胚根宽与胚根长之比小于0.9，子叶黄色，胚根基部无斑纹

窄叶野豌豆

1b.种脐棒状，种脐不是白色