小清河(济南段)支流内分泌干扰物综合激素效应分布特征研究

许燕，孙韶华，逯南南，孙莉，赵清华，贾瑞宝

山东省城市供排水水质监测中心，济南 250100

世界卫生组织(WHO)定义内分泌干扰物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)是指能改变机体内分泌功能，并对生物体、后代或种群产生不良影响的外源性物质或混合物[1]。一些EDCs能作为激素的模拟物或者阻滞剂直接作用于机体的激素受体，还有一些能直接作用于控制激素向其靶细胞或者组织传递的蛋白质，从而对人类或者动物的生殖健康、性别比例和神经发育等产生影响，引起甲状腺、肾上腺、代谢紊乱和免疫功能障碍等相关疾病。目前，已知包含农药、阻燃剂、塑料制品、个人护理品、重金属、增塑剂和抗氧化剂等在内的，超过800种化学物质具有内分泌干扰特性[2]。随着经济的高速发展，各类新型化合物的合成以及新型污染物的排放，数十万种合成化学品中只有极小部分被评估为内分泌干扰活性，人类已经完全暴露于多种EDCs广泛存在的环境中。已有研究表明，EDCs广泛分布于水生环境，可能对水生生物和人类健康构成威胁[3-4]。

由于EDCs种类繁多且多具有低浓度活性，相互之间可能产生附加或协同作用，环境EDCs筛查方法中，仪器分析法虽然能识别和量化已知的特定环境EDCs，但具有前处理复杂、仪器昂贵和耗时久等缺点[5]。生物分析法因其检测费用低、耗时短、能测定复杂化合物的综合毒性等优点，在筛查测定环境EDCs时，与仪器分析法相比有显著的优势。化学诱导荧光素酶表达基因法(chemically activated luciferase gene expression, CALUX)是一种体外生物测试法，通过测定重组哺乳动物细胞暴露于污染物所产生的荧光强度，结合毒性当量物质的响应值，来评价污染物的综合毒性效应。美国、欧盟、日本等国家和组织已将CALUX生物测定法指定为官方筛选方法。近年来，CALUX技术已被广泛应用于环境(土壤、大气和水)[6-7]、食品和人类血清[8-9]等EDCs的筛查测定。

小清河是济南市城市河流的两大水系之一，是济南市区内唯一的防洪除涝和排污河道，小清河(济南段)流域主要包括槐荫区、天桥区、市中区、历下区、历城区和章丘市，从辛丰庄出济南界，长70.3 km，汇流面积2 873.93 km2，绝大多数支流集中在主干河道南岸，成单侧羽毛状分布，基本上属于雨源型山溪河流，北岸支流较少，均属平原型坡水河流(图1)。

图1 小清河主要支流采样点分布图Fig. 1 Distribution map of the main tributaries of Xiaoqing River

本文聚焦小清河(济南段)的主要支流，采用CALUX生物测定法深度调研各支流雌激素类、二噁英类、雄激素类和肾上腺皮质激素类等4类典型EDCs的污染现状，通过为期1年的调查研究，明确了各支流4类EDCs的含量水平，揭示了不同EDCs的时空分布规律，为评估小清河支流EDCs污染风险提供数据支撑。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

仪器与试剂：LB960型微孔板式化学分光检测仪(德国Berthold Centro公司)；AC2-4S1型生物安全柜(新加坡ESCO公司)；HERA cell 150i型二氧化碳培养箱(美国Thermo公司)；CKX41型组织培养用显微镜(日本奥林巴斯株式会社)；Auto SPE-06C型全自动固相萃取仪(美国睿科公司)；正己烷、乙酸乙酯为色谱纯，美国Dikmapure公司；二甲基亚砜(DMSO)为分析纯，美国Sigma公司。

细胞系购自荷兰Biodetection Systerms B.V.(BDS)公司，其中，DR CALUX细胞是通过基因工程，使其在暴露于Ah受体(AhR)激动剂时产生荧光素酶的大鼠肝癌细胞(H4IIe)，AhR激动剂包括二噁英化合物、类二噁英多氯联苯化合物和呋喃化合物等。

ER CALUX细胞是通过基因工程，使其在暴露于雌激素受体(ER)激动剂时产生荧光素酶的人类乳腺癌细胞(T-47D)，ER激动剂包括雌激素化合物或类雌激素化合物。

GR CALUX细胞是通过基因工程，使其在暴露于肾上腺皮质激素受体(GR)激动剂时产生荧光素酶的人类成骨骨癌细胞(U2-OS)，GR激动剂包括肾上腺皮质激素化合物或类肾上腺皮质激素化合物。

AR CALUX细胞是通过基因工程，使其在暴露于雄激素受体(AR)激动剂时产生荧光素酶的人类成骨骨癌细胞(U2-OS)，AR激动剂包括雄激素化合物或类雄激素化合物。

标准物质浓度系列(2,3,7,8-四氯二苯并-对-二噁英、雌二醇、二氢睾酮、地塞米松)购自荷兰BDS公司；细胞培养基购自美国Gibco公司；Oasis HLB固相萃取柱购自美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品采集

2017年9月—2018年8月，每月对小清河(济南段)的LS、XJ、GS、XL、DL、LY、HC和DX等8条南岸主要支流进行一次水样样本采集，采样瓶须使用氢氧化钠溶液进行充分清洗，并经无水乙醇漂洗晾干，水样采集后需在4 ℃条件下运输至实验室，然后在72 h内完成过滤和前处理操作。经前处理后，利用CALUX生物测定法分别测试二噁英类、雌激素类、肾上腺皮质激素类和雄激素类的含量水平。

1.2.2 样品的前处理

测定二噁英类的样品前处理：已混匀的水样加入正己烷，用振荡器震荡萃取，静置使两相分层，将上层液相转入玻璃试管中，以平缓的氮气使试管中的正己烷蒸发。重复以上液液萃取2次后，将浓缩液通过硫酸硅胶柱，完成对有机物、脂肪和不稳定多环芳烃等的氧化。净化后的提取液以平缓的氮气吹干，加入DMSO溶液，-20 ℃保存，以待细胞分析测定。

测定雌激素类、雄激素类和肾上腺皮质激素类的样品前处理：样本混匀后经0.45 μm滤膜过滤后，经已活化的HLB固相萃取柱富集，用乙酸乙酯洗脱固相萃取柱3次，以平缓的氮气浓缩洗脱液，氮吹后加入DMSO溶液，-20 ℃保存，以待细胞分析测定。

1.2.3 CALUX法检测

根据ISO17025认证推荐的标准操作方法[10]进行检测，首先，将细胞悬浮液按一定的稀释比例，植板于96孔微孔板，孵育16 h。然后，无菌条件下转移出微孔板的培养基，将预先制备的含特定剂量样本的培养基、含特定浓度剂量的标准参照物的培养基填充至96孔板，孵育24 h后，从微孔板中移出所有培养基，每孔加入30 μL细胞消散试剂，测定萤光素酶活性。

1.3 数据统计与分析

对照标准参照物系列的荧光强度，使用数据分析软件制作剂量-响应曲线，得出样品中不同EDCs的当量值，即分别使用17β-雌二醇(E2)、二氢睾酮(DHT)、地塞米松(Dex)、2,3,7,8-四氯二苯并-对-二噁英(2,3,7,8-TCDD)来表征雌激素类、雄激素类、肾上腺皮质激素类和二噁英类的内分泌活性的浓度。

数据分析时，低于检出限的测试结果，统一赋为检出限一半的值，用于计算平均值。

2 结果(Results)

2.1 小清河(济南段)主要支流EDCs含量水平及分布特征

2.1.1 二噁英类

结果表明，在为期1年的调研周期内，小清河(济南段)8条支流的二噁英类毒性当量浓度范围为

图2 不同季节二噁英类含量水平Fig. 2 Dioxin levels in different seasons

由图3可知，8条支流的年平均毒性当量浓度为0.020～0.040 ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1，二噁英类的含量分布较为平均，仅一条河流二噁英类含量高于美国环境保护局(US EPA)饮用水中二噁英含量标准0.030 ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1，本研究调研小清河的支流主要为城市内部泄洪的季节性河流，因此得出调研支流的二噁英类污染风险较低。

2.1.2 雌激素类

由图3可知，8条支流雌激素类的年平均毒性当量浓度为0.007～0.050 ng E2-eq·L-1，除HC支流的年平均毒性当量浓度达0.050 ng E2-eq·L-1外，其余支流雌激素类活性浓度均在0.020 ng E2-eq·L-1左右。

由图4所示，雌激素类检测结果表明，2017年9月—2018年8月，LS、XJ和DX等3条支流全年未检测到雌激素类活性(

图4 雌激素类分布特征Fig. 4 Characteristics of estrogen distribution

2.1.3 肾上腺皮质激素类

肾上腺皮质激素类的年平均毒性当量浓度为1.8～9.6 ng Dex-eq·L-1，由图3可知，有4条支流年平均肾上腺皮质激素类毒性当量低于方法检出限(LOD=3.9 ng Dex-eq·L-1)，其余支流年平均肾上腺皮质激素类毒性当量浓度范围为4.4～9.6 ng Dex-eq·L-1。

测试结果表明，XJ支流全年未检测到肾上腺皮质激素类活性(

图5 肾上腺皮质激素类分布特征Fig. 5 Characteristics of glucocorticoid distribution

2.1.4 雄激素类

雄激素类除2018年2—3月在DL、XL和GS支流各检出一次外，其余均未检测到雄激素类活性(

2.2 小清河(济南段)支流EDCs对水环境污染的贡献

由图3和图6可知，在调研期内，小清河(济南段)的主要支流都受到了4类EDCs不同程度的污染，位于居民区和商业区的GS、DL和XL等3条支流均检测到了4类EDCs活性，由地下泉水汇流而成的HC和LY支流检测到了除雄激素类之外的其余3类EDCs活性，LS和DX支流检测到了二噁英类和肾上腺皮质激素类活性，XJ支流只检测到二噁英类活性。

图3 二噁英类、雌激素类和肾上腺皮质激素类年平均含量分布注：二噁英的含量单位为ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1；雌激素的含量单位为E2-eq·L-1。Fig. 3 Average annual distribution of dioxin, estrogen and glucocorticoidNote: The unit of dioxin content is ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1; the unit of estrogen content is E2-eq·L-1.

由图6可知，CALUX生物分析法测定的小清河(济南段)支流中每类EDCs的毒性当量对4类EDCs的贡献分析结果显示，肾上腺皮质激素类、二噁英类、雌激素类和雄激素类等4类EDCs中，对水环境EDCs污染贡献最大的是肾上腺皮质激素类，占比均达90%以上。

图6 4种内分泌干扰物(EDCs)对各支流水环境污染的贡献Fig. 6 Contribution of four endocrine disrupting chemicals (EDCs) to river water environment

3 讨论(Discussion)

3.1 二噁英类

有文献报道，环境中二噁英类的主要来源是焚烧的大气沉积[12]，这可能是二噁英类在小清河(济南段)主要支流中分布较为平均的原因。近年来针对环境二噁英污染的研究，大多集中在大气[5]、土壤[13]的含量筛查，利用生物方法对水环境中二噁英类的研究，多以地表水[14]、污水[15]和沉积物[16-18]为研究对象，Shi等[19]使用EROD生物测试法评价了我国长江、淮河和太湖流域的二噁英类含量为0.062～0.116 ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1；黄楚琴等[20]应用酵母报道基因系统，检测了我国广州市内河涌水体二噁英类含量范围为0.0136～50.1890 ng·L-1，污染较为严重的可能原因是工业排污和大量的水陆交通尾气排放，珠江水体二噁英类当量范围为0.0130～6.2210 ng·L-1。我国济南市河流夏季处于丰水期，由于降水量大且调研支流多为泄洪河道，大气中含二噁英类的颗粒物随着雨水汇入各支流，此类物质化学性质非常稳定且难以被降解，这可能是各支流夏季二噁英类含量水平高于其他三季的主要原因。对比近年来我国南方重要流域的二噁英类含量报道，小清河(济南段)主要支流受二噁英类的污染程度较低。

3.2 雌激素类

众多学者使用生物分析法对各国家河流的雌激素类毒性含量进行了测试，如表1所示，比较发现，小清河(济南段)主要支流雌激素类的含量与文献报道的其他国家河流相比[10,17,19,21-24]，含量水平相对较低，说明雌激素类的污染风险较低。

表1 各国河流水中雌激素类活性的相关研究Table 1 Some research about estrogen activity in river waters of different countries

有学者证实了细菌在需氧和厌氧条件下，具有降解环境中雌激素类固醇的作用[25-26]，Vandermarken等[17]从体外生物降解实验中，也发现河流中天然存在的细菌群落对雌激素类EDCs具有一定的自净能力。本研究所调研河流多具有城市泄洪功能，济南夏秋两季雨水丰盛，河流中天然细菌群落较为丰富，细菌群落对雌激素类EDCs的天然降解及较大雨水量的自然稀释，可能是夏秋季节雌激素类活性低的原因。此外，有研究表明，雌激素类大多来自城市、农业或家庭排放的小分子[27-28]，5条检出雌激素类的支流分布在人口较为密集的居民区，因此，家庭废水排放对河流中雌激素类的污染不容忽视。

3.3 肾上腺皮质激素类

近年来，应用CALUX法筛查评估地表水、河流中肾上腺皮质激素类的含量也见诸报道。已有研究报道了捷克共和国和瑞士的河流、莱茵河流域(荷兰境内的部分)、荷兰某地表河流的肾上腺皮质激素类含量水平为

一定量的肾上腺皮质激素，主要通过哺乳动物尿液排出体外，通过污水处理厂或潮湿天气径流排放到水生环境中，并成为水生环境中潜在的污染物[33]。而本研究中DX河河道最长，流经区域复杂包含居民区、工业区和农业区，该支流取样点处于下游且接收了污水处理厂排放的出水，贾瑞宝等[34]研究发现现行污水处理工艺对肾上腺皮质激素类EDCs的去除能力有限，处理后出水的肾上腺皮质激素类当量浓度依然较高，这些可能是导致该支流全年检出肾上腺皮质激素类活性且当量浓度较高的原因。荷兰学者对地表水和污水出水中多种激素活性的研究也有类似的发现，他们观测到所测试的环境水样中雄激素类、孕激素类和肾上腺皮质激素类活性水平大多高于雌激素类水平[10]。

对比已报道的数据来看，4条检出肾上腺皮质激素类的小清河(济南段)支流已经受到了该类EDCs较大程度的污染，其含量水平高于已报道的饮用水中的肾上腺皮质激素类浓度，小清河作为济南市重要的城市内部河流，其支流水环境中存在显著水平的肾上腺皮质激素类EDCs应该引起重视。

3.4 雄激素类

Shi等[19]在中国东部长江、淮河和太湖流域的雄激素类含量水平筛查中，未发现雄激素类活性，本研究团队运用CALUX法测试了济南市4座水库二噁英类、雌激素类、肾上腺皮质激素类和雄激素类的含量水平，二噁英类当量浓度范围为0.009～0.250 ng 2,3,7,8-TCDD TEQ·L-1，雌激素类当量浓度范围0.040～0.250 ng E2-eq·L-1，未发现肾上腺皮质激素类和雄激素类活性[35]。河流水中雄激素活性的相关报道较少，由测试结果可得出小清河(济南段)支流受雄激素类EDCs的污染水平较低。

城市河流作为重要的泄洪排污方式，其EDCs等新型污染物的污染也应该引起相应的重视。从调研结果看出，在为期1年的调研期内，小清河(济南段)主要支流均受到4类EDCs不同程度的污染，对比已报道的国内外研究数据，二噁英类和雌激素类的污染水平总体较低，受雄激素类EDCs的污染风险较低，4类EDCs中肾上腺皮质激素类的毒性当量对水环境污染贡献最大。

未来研究中，将生物分析作为快速筛查手段，筛选污染物类型，再结合化学分析精准定位污染物，实现生物分析和化学分析的有效结合，为水环境污染物筛查和污染物去除研究提供数据支撑。

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