STAT3-siRNA表达载体对肝癌细胞pim-2基因表达的影响

刘 洋，陈立军，靳秋月，袁建龙

（1.内蒙古医科大学附属医院检验科，内蒙古 呼和浩特 010050；2.武警后勤学院卫生勤务系）

pim基因属于丝氨酸/苏氨酸细胞蛋白激酶（proviral integration site of murine）家族，对凋亡诱导通道进行有效的控制不仅可有效阻止染色体异常细胞凋亡，而且还能够对细胞周期进行实时调控，一旦染色体分离会产生影响，导致失败，同时还会呈现出多倍性，此时也就会出现恶性肿瘤[1～3]。本实验通过STAT3-si RNA表达载体转染肝癌SMMC-7721细胞株，研究STAT3-siRNA表达载体对更有助于对STAT3信号转导通路进行研究，同时还便于分析下游pim-2基因的表达。

1 材料与方法

1.1 材料

si LentGeneTM-2 U6 Hairpin Cloning System（Human）试剂盒在此次实验中我们所选定的供应商为Promega公司、购自NEB公司的限制性内切酶EcoRⅤ、购自博奥申公司的质粒提取试剂盒、总RNA提取试剂在此次实验中我们所选定的供应商为Invitrogen公司、RT-PCR试剂盒在此次实验中我们所选定供应商为索来宝公司、购自Promega公司的CodeBreakerTMsiRNA脂质体转染试剂、购自Santa Cruz公司的PIM-2单克隆抗体、购自博奥申公司的β-actin单克隆抗体、由大连宝生物公司合成的STAT3基因片段、由上海赛百盛公司合成的内参βactin引物和pim-2引物。

1.2 细胞培养

肝癌细胞株SMMC-7721放置在CO2培养箱内培养，5%CO2，37℃静置培养，培养基为含10%的小牛血清RPMI-1640。

1.3 化学合成si RNA

从Genebank获取人STAT3mRNA全序列（序列号：NM003150）。在RNA干扰设计原则的指导下，寻找干扰RNA的靶序列，该序列在对EST基因库进行检索时主要采用了BIast，这样就可以保证是独一无二的靶向基因，同时需要保证STAT3特异性的，对于其他基因的表达没有任何的抑制，同时该部位也没有任何的碱基多态性，1426-1444的核苷酸碱基序在此时也就可以确定TTGAATTCTGCAGAGAGGC，是RNA的干扰序列。按照promega公司siLentGeneTMU6盒RNA干扰系统的引物设计的原则，构建序列的下游引物。该下游引物囊括了5＇端磷酸基、局部EcoRⅤ序列、U6所对应的终止序列、靶序列所对应的反义互补序列、袢环以及靶序列形成回文茎环结构、U6盒配对序列，如下：5'-ATCTAAAAAGCCTCTCTGCAGAATTCAATCTCT TGAATTGAATTCTGCAGAGAGGCGGTGTTTCGTCC TTTCCACAAGA-3'

1.4 重组载体si RNA的构建

使用试剂盒扩增系统扩增发夹结构，在T4 DNA连接酶作用下，将纯化好的SECs与psiLentGeneTM载体置于4℃连接，此时需要一直过夜，向DH5α转化，后续所展开的抗性筛选主要采用了Amp，基于平板来进行培养。阳性克隆提取DNA，用EcoRⅤ酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定。成功筛选阳性重组质粒后，对其进行测序，psiLent GeneTM载体此时也就证明被插入目的DNA片段。

1.5 RT-PCR检测pim-2 mRNA水平表达的变化

肿瘤组织总RNA的提取在此次实验中主要采用了Trizol试剂，后续所进行的操作必须要严格的遵循RT-PCR试剂盒说明书。反应条件为94℃5min，94℃50s→55℃50s→72℃1min 35cycle，72℃8min。Pim-2引物序列为，sense：5'CATTCCCGTGGAGTTGTC3'；antisense：5'CATCCTCGGCTGGTGTTT3'；扩增产物长度为415bp。β-actin引物序列为，sense：5'GTGGACATCCGCAAAGAC3'；β-actin antisense：5'GAAAGGGTGT AACGCAAC；扩增产物长度在经过了测定后也就可以确定为302bp。基于1%琼脂糖凝胶电泳，这样也就可以实现对产物的扩增，接下来需要扫描，这一操作需要用到的设备为BIO-RAD图象分析仪，能够对结果数据进行详细记录。

1.6 检测PIM-2蛋白表达水平的变化基于Western blot

基于肿瘤组织还需实施超声破碎，在对肿瘤组织进行处理时首先要选取定量的蛋白上样缓冲液，然后煮沸，充分的混合均匀，后续也就可以将其保存在-20OC的温度条件下。之后是对SDS-PAGE分离胶和浓缩胶进行配制，浓度分别为10%和5%。对所保存样品进行取样，容量为20μL，之后进行90V恒压电泳和20V恒压电泳，时间分别设定为1h和2h。上述操作完成后进行凝胶提取，4℃、90V恒压电转1～2h。取出PVDF膜，加1：500稀释的PIM-2一抗溶液，再在4℃环境中进行过液。之所以对所收取的进行微微振荡其目的是为了更好的将反应液过滤，然后选择PBS进行洗涤，次数为3次。最后是染色操作，可选用DAB染色试剂来进行，同时使用相机进行拍照。

1.7 统计学处理

对于实验结果需进行统计学分析，可借助SPSS 11.0统计来实现。

2 结果

2.1 重组质粒载体的构建与鉴定

基于重组质粒需进行EcoR V酶切，然后与空载体酶进行对比分析。另外还需实施凝胶电泳，这样酶切质粒，此时也就获得了载体片段以及小片段，对应分子量为4000bp以及300bp。而空载体经酶切后只有一条约4000bp的载体片段。重组质粒是否构建成功可通过测序结果进行体现，同时还能够判断所插入的DNA序列是否正确。

图1 重组质粒酶切鉴定图

图2 重组载体测序图

2.2 RT-PCR检测pim-2 mRNA表达

基于条带亮度来实现对pim-2mRNA表达有效的判断。实验结果（见图3），通过分析测试结果了解到空转染试剂组（SMMC-7721）、空质粒组（SMMC-7721）、pim-2基因（SMMC-7721）变化并不明显，基因表达量减少变化最大的当属SMMC-7721 STAT3-SECs表达载体组pim-2基因。

图3 STAT3-siRNA表达载体转染SMMC-7721细胞后pim-2 mRNA水平

2.3 Western Blot检测PIM-2蛋白表达

基于PIM-2蛋白的表达水平可借助Western Blot进行检测，在34KD处标定特异条带，选择βactin作为基准，对PIM-2和β-actin显色条带进行灰度扫描，结果显示其与β-actin表达一致，在这一环节中表达量变化程度最大的当属PIM-2蛋白，而SMMC-7721空转染试剂组、空质粒组PIM-2蛋白表达量并无实质变化。

图4 STAT3-siRNA表达载体转染SMMC-7721细胞后PIM-2蛋白表达水平

3 讨论

越来越多的研究人员开始关注RNA干扰（RNA interference，RNAi）、小分子干扰RNA片段（small interfering RNA，siRNA）。RNA能够使基因mRNA被双链RNA分子敲除，表现要优于正义和反义RNAi[4，5]。RNAi最可实现对基因表达的调节或关闭。而siRNA即RNAi阶段产生的小双链RNA分子，大约拥有2l-25个核苷酸，属于核心中间效应分子，当前siRNA已经被人工合成，可将mRNA有敲除[6]。si RNA在基因治疗和基因功能研究中有着广泛应用。

有关激活子和转录信号传导子从本质上来讲皆属于STAT3重要的组成成员[7～9]。在家族基因分类上pim基因可归属到丝氨酸/苏氨酸细胞蛋白激酶的范畴，其能够更好促进细胞增殖[1～3]。在Pim激酶的表达调控中，STATs扮演着非常关键的角色，STAT3／STAT5在被活化后，其可以结合于ISFR／GAS序列，这在很大程度上可以上调pim-1基因表达[10，11]，受体酪氨酸激酶FLT3在白血病中能够起到关键作用，同时还可以对pim-1基因进行表达。STATs根据研究显示其显著关联着Pim-1激酶，受到后者的负反馈调节，Pim-1激酶使得SOCS1／SOCS3被磷酸化，让SOCS1／SOCS3分子可以展现出更高的稳定性，对于STATs活性有间接抑制的作用[12]。通过对stat3和pim家族的关系分析了解到前者能够对后者的表达进行调控，这不仅有利于对pim家族作用机制进行分析，而且还便于STAT3信号转导通路作用的发挥。应用RNAi技术研究stat3对肝癌SMCC-7721肿瘤细胞中pim-2基因的影响还未见报道。

基于STAT3的研究是建立在前人实验的基础之上，同时再辅以RNAi技术，进而对人肝癌SMMC-7721细胞进行分析，研究过程中所选择的靶点为STAT3第400～500位之间的氨基酸，并以此为基准进行构建表达载体，最后对pim-2基因表达的影响进行探究。通过分析可以看出，不管是mRNA水平，或者是细胞水平都表现出了pim-2基因的抑制作用。综上所述不论是细胞水平还是蛋白水平都能够在特定条件下发挥其功能优势，能够对pim-2基因的表达效果起到良好的抑制作用。基于肿瘤基因的临床治疗可借鉴细胞水平上RNAi，原因在于其能够肝癌治疗提供强有力的实验基础。有关体外肿瘤细胞基因的培养仅仅借助RNAi技术还存在一定的漏洞，仍需不断对其进行完善，其切入点可选择siRNA使用剂量和siRNA人体方式，通过不断深入研究进而解决siRNA对人体所造成的副作用问题。有关转染率的提高、使用什么方式对siRNA表达载体作用最多的时间、通过何种方法检测其转染效率、shRNA可以稳定进行表达与否、表达shRNA效率情况等，这些问题需要进行深入的分析研究。