血浆骨粘连蛋白水平影响因素的研究

吴乌德勒胡，包 旭，齐金新，赵雅欣，李冬梅

（1.内蒙古自治区人民医院内分泌科，内蒙古 呼和浩特 010017；2.内蒙古科技大学包头医学院；3.内蒙古医科大学）

随着经济的发展，中国的城市化进程明显加快，同时人口老龄化的加速等原因，我国糖尿病患病率仍在上升，最新调查结果显示，18岁及以上人群糖尿病患病率为11.2%，其中以2型糖尿病（T2DM）为主，占90%以上。同时肥胖和超重人群糖尿病患病率显著增加，从体重指数（BMI）方面调查显示，25kg/m2≤BMI＜30kg/m2者糖尿病患病率为13.8%，BMI≥30kg/m2者糖尿病患病率为20.1%[1]。近年来，骨粘连蛋白（osteonectin，ON）引起大家的极大关注，它与糖尿病和肥胖密切相关。ON最初被发现于骨骼，也被称为富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC），也被称为BM-40。ON主要存在于细胞外基质，在胰岛、脂肪组织、肝脏和骨骼肌等多个组织中均有表达，是一种由多种细胞分泌的多功能糖蛋白，它还参与骨生成、血管形成、伤口愈合、肿瘤、肝肾纤维化和抑制脂肪生成等过程[2，3]。最近研究发现，属于糖代谢负调节因子的微小RNA-29（miR-29）家族通过抑制ON合成来抑制葡萄糖摄取，miR-29s/ON通路在糖代谢中起重要作用[4]。ON在ob/ob小鼠平滑肌组织中呈现高表达，可能参与了胰岛素抵抗与糖尿病及其并发的动脉粥样硬化的过程[5]。ON可增强骨骼肌AMPK依赖的葡萄糖摄取，可改善饮食诱导肥胖小鼠的糖耐量和胰岛素抵抗，以及对改善代谢紊乱有重要作用[6]。ON基因敲除小鼠表现出糖代谢异常，随着年龄的增长，脂肪组织的沉积也会增多，影响葡萄糖稳态[7]。较低的ON水平可能是健康肥胖的早期标志物[8]。肥胖者ON mRNA的表达高于非肥胖者，ON的表达受到脂肪含量、瘦素、血糖及胰岛素水平的影响[2]。

但是，目前对于血浆ON水平影响因素方面的报道相对较少。ON是一种分泌蛋白，多项研究表明ON与糖脂代谢密切相关，本研究通过动物实验和临床观察来探讨血浆ON水平的影响因素以及分析其分泌特点，为ON可能成为糖尿病和肥胖的治疗新靶点机制研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 基础研究对象实验采用雄性C57BL/6J小鼠，小鼠被安置在一个可控的环境中，自由饮水，并以高压灭菌的CE-2饮食（CLEA日本）作为食物喂养。用血糖仪Freestyle Freedom（日本大阪，Nipro）测量血糖浓度。

1.1.2 临床观察对象收集自2018-11～2020-11于内蒙古自治区人民医院内分泌科收治的2型糖尿病伴超重或肥胖病人36例，进行馒头餐试验。

1.2 方法

1.2.1 禁食试验采用8周龄雄性C57BL/6J小鼠，禁食前和禁食24h后分别测定体重、血糖、胰岛素和骨粘连蛋白水平。葡萄糖负荷试验：采用6周龄雄性C57BL/6J小鼠，禁食6h后，经口给予葡萄糖（2g/kg体重）或PBS缓冲液，并在灌糖后0、15、30、120 min分别测定血糖、胰岛素和骨粘连蛋白水平。胰岛素负荷试验：采用9周龄雄性C57BL/6J小鼠，腹腔注射人胰岛素（Humarin，Eli Lilly，Kobe，日本）（1U/kg体重）或PBS缓冲液。给药后0、20、40、60min分别测定血糖和骨粘连蛋白水平。

1.2.2 馒头餐试验选取36例T2DM伴超重或肥胖的患者，空腹状态下进食150g馒头，在餐前和餐后2h分别测定血糖、胰岛素及骨粘连蛋白水平。

1.3 统计学分析

采用学生t检验，所有数据均以平均值±标准差表示。检验水准为α＝0.05，P＜0.05说明组间差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 禁食试验中骨粘连蛋白水平

在禁食试验中，与禁食前相比较，禁食后的体重显著下降[（23.64±1.13）g vs（19.93±0.92）g，P＜0.05]，血糖显著降低[（95.5±14.25）mg/dL vs（63.64±6.31）mg/dL，P＜0.05]，胰岛素水平显著降低[（746.7±333.49）pg/mL vs（228.4±200.12）pg/mL，P＜0.05]。但是，血液中骨粘连蛋白水平无明显变化[（262.08±82.38）ng/mL vs（215.47±66.67）ng/mL，P＞0.05]（见图1）。

图1 禁食试验中骨粘连蛋白水平

2.2 葡萄糖负荷试验中骨粘连蛋白水平推移

在葡萄糖负荷试验中，与PBS缓冲液组小鼠相比较，葡萄糖负荷组小鼠的骨粘连蛋白水平无明显差异（见图2）。血糖变化：0min[（147.0±5.60）mg/dL vs（138.7±10.16）mg/dL，P＞0.05]，15min[（211.2±12.90）mg/dL vs（358.8±15.75）mg/dL，P＜0.05]，30min[（218.5±22.22）mg/dL vs（347.3±29.15）mg/dL，P＜0.05），60min[（214.2±28.60）mg/dL vs（308.3±58.06）mg/dL，P＜0.05]，120min[（186.2±15.85）mg/dL vs（227.0±23.67）mg/dL，P＜0.05]；胰岛素变化：0min[（950.5±551.93）pg/mL vs（844.8±211.63）pg/mL，P＞0.05]，15min[（833.3±300.33）pg/mL vs（2080.9±474.01）pg/mL，P＜0.05]，30min[（849.0±323.72）pg/mL vs（1267.8±175.09）pg/mL，P＜0.05]，120min[（884.9±225.97）pg/mL vs（1015.4±193.94）pg/mL，P＞0.05]；骨粘连蛋白水平推移：0min[（106.1±40.52）ng/mL vs（115.5±23.34）ng/mL，P＞0.05]，15min[（122.5±31.73）ng/mL vs（122.6±24.74）ng/mL，P＞0.05]，30min[（119.8±29.70）ng/mL vs（115.7±19.07）ng/mL，P＞0.05]，120min[（105.5±29.09）ng/mL vs（116.5±23.72）ng/mL，P＞0.05]。

图2 葡萄糖负荷试验中骨粘连蛋白水平推移

2.3 胰岛素负荷试验中骨粘连蛋白水平推移

在胰岛素负荷试验中，与PBS缓冲液组小鼠相比较，胰岛素负荷组小鼠的骨粘连蛋白水平无明显差异（见图3）。血糖变化：0min[（91.8±4.34）mg/dL vs（101.7±12.33）mg/dL，P＞0.05]，20min[（140.5±12.50）mg/dL vs（61.3±6.69）mg/dL，P＜0.05]，40min[（164.8±23.63）mg/dL vs（70.9±4.94）mg/dL，P＜0.05]，60min[（199.0±12.66）mg/dL vs（88.4±9.33）mg/dL，P＜0.05]；骨粘连蛋白水平推移：0min[（168.6±72.99）ng/mL vs（188.6±61.77）ng/mL，P＞0.05]，20min[（143.5±74.38）ng/mL vs（211.8±71.48）ng/mL，P＞0.05]，40min[（206.8±62.50）ng/mL vs（220.5±89.06）ng/mL，P＞0.05]，60min[（236.6±110.18）ng/mL vs（254.6±73.85）ng/mL，P＞0.05]。

图3 胰岛素负荷试验中骨粘连蛋白水平

2.4 临床观察高碳水化合物刺激对骨粘连蛋白分泌水平的影响

在馒头餐试验中，比起餐前，餐后2h血糖显著升高[（8.8±2.17）mmol/L vs（15.2±4.0）mmol/L，P＜0.05]，胰岛素水平显著升高[（11.0±7.19）uU/mL vs（45.6±30.49）uU/mL，P＜0.05]。但血液中骨粘连蛋白水平无明显差异[（93.1±30.81）ng/mL vs（97.9±29.49）ng/mL，P＞0.05]（见图4）。

图4 馒头餐试验中骨粘连蛋白水平变化

3 讨论

本研究通过动物实验和临床研究，在饥饿试验、高糖及胰岛素刺激下评估了血浆ON浓度变化，结果无论在小鼠还是在人体，刺激前后的血浆ON水平均未见明显变化。有研究报道，急性极限运动刺激后，血清ON水平同样没有显著变化，这与我们的研究结果是一致的[9]。

表1 2型糖尿病患者基本情况

ON与糖尿病以及胰岛素分泌密切相关。链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠β细胞功能失调而胰岛素的分泌减少，其ON在胰腺中表达显著下调[10]。在人的胰岛中观察ON表达与葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）的关系，发现糖尿病患者ON的表达减低，ON的表达与GSIS呈正相关。此外，在人工培养的胰岛β细胞（INS-1）中，ON的过度表达导致葡萄糖刺激下的胰岛素分泌比对照细胞增加2.4倍。研究指出，ON的这种调节作用涉及WNT信号通路和参与β细胞变化的若干相关基因[11]。ON的缺乏降低了胰岛β细胞胰岛素的表达和葡萄糖刺激的胰岛素分泌，这种情况在高脂饮食喂养的动物中更为显著，ON是调节胰岛素表达和分泌所必需的[7]。在β细胞中，G蛋白信号调节因子4（RGS4）通过调节M3受体G蛋白偶联调节胰岛素分泌，是已知的胰岛素分泌的负调节因子，ON通过下调RGS4的表达来调节胰岛素分泌[12]。ON在胰岛素分泌和保持胰岛β细胞功能上具有潜在的调节作用。

ON是一种分泌蛋白，分泌蛋白一般有两种途径从细胞中分泌，也就是调节型分泌途径和组成型分泌途径[13]。众所周知，胰岛素的分泌是通过调节型分泌途径完成的，胰岛素原从内质网移动到高尔基体区域，随后不久被包装成分泌颗粒，然后转化为胰岛素，在葡萄糖刺激下分泌到细胞外[14]。ON在细胞质合成后进入高尔基体，在信号肽的引导下分泌到细胞外。研究发现，胰腺基质细胞中ON的表达受胰岛素和葡萄糖的调节[15]。胰岛素和瘦素作用下可增加脂肪组织中ON的表达[2]。但我们的研究结果显示，血浆ON水平在短时间内不受葡萄糖和胰岛素刺激的影响。

综上所述，ON参与调节胰岛素分泌，其表达和分泌也受胰岛素等代谢指标的影响，但血浆ON水平在短时间内不受代谢参数以及饥饿应激的影响，其分泌特点不同于胰岛素分泌途径，是以组成型分泌途径分泌到细胞外。本研究在ON与糖尿病和肥胖相关机制研究提供科学依据。