不同浓度乙二胺四乙酸在产ESBLs多重耐药肺炎克雷伯菌对哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星与左旋氧氟沙星3种药物体外敏感性的恢复作用

温庆辉,徐军发,李燕嫦,黄金印

0 引言

随着抗菌药物种类增加,抗菌药物滥用等情况导致耐药菌株产生,并且变化速度快[1]。肺炎克雷伯菌是革兰阴性菌,肠杆菌科属,属于条件致病菌,能够引起消化系统感染、泌尿系统感染和呼吸道感染等,其也是导致院内感染的重要原因之一[2]。近年来,广谱抗菌药物使用范围扩大,肺炎克雷伯菌对多数一线药物产生耐药性,其耐药机制是产生碳青霉烯酶、AmpCβ内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶等[3- 4]。耐药菌株常同时携带碳青霉烯类、氨基糖苷类、喹诺酮类、氯霉素、磺胺类等耐药基因,具有多种耐药机制,呈多重耐药的特点。

乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)是一种金属螯合剂,曾被用于治疗铅、汞等中毒。由于其能隔绝镁离子、钙离子、铁离子、锌离子,也被作为渗透剂及加强剂用于治疗与医疗设备、牙科、兽医类有关的有菌膜生长的伤口,其能够增加细菌细胞壁厚度,引起菌膜萎缩,发挥治疗作用。研究表明,EDTA能够控制尿道、血管内细菌菌膜的生长,减少感染发生,也能结合活性物质如抗生素、乙醇、碘、银等控制菌膜、微生物生长[5-6]。目前,关于EDTA在恢复多重耐药肺炎克雷伯菌对部分抗菌药物敏感性中的作用的研究较少。本研究选取多重耐药肺炎克雷伯菌患者作为研究对象,分析不同浓度EDTA在恢复多重耐药肺炎克雷伯菌对哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星与左旋氧氟沙星3种药物敏感性中的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取我院2018年1月至2019年12月产ESBLs多重耐药肺炎克雷伯菌感染患者36例,其中男23例,女13例,平均年龄(50.67±5.94)岁;根据不同感染部位分布,呼吸道感染及泌尿道感染最常见,其次是消化道与切口部位;其中肺部感染16例,泌尿系感染11例,腹部感染5例,伤口感染4例。药敏报告显示，对哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星与左旋氧氟沙星3种药物敏感。本研究经医院伦理委员会审批。

1.2 试剂 EDTA注射液(天津金耀氨基酸有限公司,批号:0504091);哌拉西林他唑巴坦钠(国药准字J20150041,惠氏制药有限公司);阿米卡星(国药准字H23021795,哈药集团三精制药有限公司);左旋氧氟沙星(国药准字H20010538,江苏涟水制药有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 体内治疗与观察 采取倍比稀释法配置高、中、低3种不同浓度的EDTA[高浓度EDTA注射液1g，qd(出厂成品);中浓度EDTA注射液0.5 g,qd(经1∶2稀释而成);低浓度EDTA注射液0.25 g,qd(经1∶4稀释而成)],分别将患者随机分为低浓度组、中浓度组及高浓度组，各12例,观察临床疗效及不良反应。

1.3.2 体外药敏试验和生物膜抑制试验 先将受试药物配成相应浓度的溶液,然后采取琼脂平皿二倍稀释法,分受试药物组、受试药物+低EDTA组、受试药物+中EDTA组、受试药物+高EDTA组,各组平皿加入2 mmol/L的106cfu/ml,分别测定产ESBLs的肺炎克雷伯杆菌的MIC。

1.3.3 生物膜抑制试验 将LB肉汤培养18 h的肺炎克雷伯菌用新鲜LB肉汤(0.25% 葡萄糖)按1∶1 200比例稀释。将 0.2 ml稀释后的菌液加入96孔平底组织培养盘,每株分别移入4个平行孔。在37 ℃培养18 h后,用移液器吸头吸干每孔菌液,然后用PBS(pH7.2)缓冲液洗板3次,然后用Bouin固定液固定,用结晶紫染色,洗去未黏附细菌,晾干,每孔加入200 μl丙酮乙醇,微振荡,酶标仪检测每孔的A570 nm值。生物膜形成阳性株筛选条件为:阴性对照菌株平均A值+3倍标准差为界定值,以平均A值大于界定值为生物膜形成株。

2 结果

2.1 肺炎克雷伯菌MIC测定 哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星与左旋氧氟沙星加入EDTA后,肺炎克雷伯菌MIC降低,敏感性恢复。与受试药物组比较,低、中、高浓度EDTA组MIC显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与低浓度EDTA相比,中、高浓度EDTA组MIC显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与中浓度EDTA相比,高浓度EDTA组MIC降低,但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 肺炎克雷伯杆菌MIC测定(mg/L,n=20)

2.2 EDTA增强抗菌药物对肺炎克雷伯菌生物膜形成的抑制作用 哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星与左旋氧氟沙星加入EDTA后,肺炎克雷伯菌生物膜形成的抑制作用降低。与空白组相比,受试药物组及低、中、高浓度EDTA组抑制作用显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与受试药物组相比,低、中、高浓度EDTA组抑制作用显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与低浓度EDTA相比,中、高浓度EDTA组抑制作用显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 EDTA增强抗菌药物对肺炎克雷伯杆菌生物膜形成的抑制作用(n=9)

3 讨论

多重耐药菌是指对β-内酰胺类、红霉素、氨基糖苷类3种或3种以上的抗菌药物均耐药,耐药菌株呈逐渐上升趋势,其以产革兰阴性菌最为普遍。目前,多重耐药菌已成为医学界关注的焦点,关于多重耐药细菌感染患者治疗仍是临床治疗难点。病原学随着病情、环境的不同发生变化,临床感染的多重耐药菌分布也发生了改变。近年来,对多重耐药的抗菌药物敏感性的恢复作用引起国内外学者的关注,并开展了一些研究,但不同浓度的EDTA是否能恢复抗菌药物对多重耐药菌敏感性方面,目前国内研究甚少。

肺炎克雷伯菌产生耐药的机制:①药物灭活酶:耐药性产生的主要机制。肺炎克雷伯菌属于革兰阴性菌,产生多种β-内酰胺酶,水解内酰胺,破坏具有内酰胺结构的抗菌药物,使其丧失活性。肺炎克雷伯菌对新研发的抗菌类药物，合成β-内酰胺酶、碳青霉烯酶和氨基糖苷钝化酶等,作用于抗菌药物,使其丧失活性,产生耐药性[7]。②生物膜:细菌外膜未覆盖被膜物质,当所处环境恶劣时,肺炎克雷伯菌在细胞膜外生成膜,对抗不良因素,保护菌体,使肺炎克雷伯菌免受侵袭[8]。生物膜表面附着的物质,形成营养物质的输送渠道,保证营养充足供给细菌,与无生物膜细菌相比,其生理特征、侵袭力以及菌体形态等更有优势,对免疫系统攻击产生抵抗力,导致抗菌药物不能作用于菌体,引起药物失效。③膜孔蛋白的缺失:肺炎克雷伯菌细胞膜上的通道由孔蛋白构成,经此通道为其提供良好的外界物质。若膜孔蛋白发生改变,导致抗菌药物无法渗入菌体内部,不能发挥作用而失效[9]。④基因突变:对氟喹诺酮类产生耐药的主要机制是DNA旋转酶中CyrA 和拓扑异构酶ParC的构象和结构发生变化,导致抗菌药物无法同酶-DNA复合物结合,其抑制细菌DNA合成的作用受到阻止,出现耐药性[10]。⑤细菌外排泵作用:肺炎克雷伯菌有向外界排泄有害物质的系统,该排泄系统排泄的物质不具有特异性,多种菌株能够构成不同能力的排泄系统,当外排系统作用增加,对多种抗菌药物外排增加,导致肺炎克雷伯菌对多种抗菌药物产生强耐药,即多重耐药性[11-12]。Niu等[13]研究了EDTA与美罗培南联合应用的体外抗菌活性，结果显示,EDTA浓度达到一定程度,美罗培南在低浓度抑菌率逐渐上升,美罗培南对于耐药肺炎克雷伯菌在较低浓度就可以发挥良好的杀菌效果。

根据本文中产ESBLs多重耐药肺炎克雷伯菌感染部位及致病性的不同,发现机体发生呼吸道与泌尿道的感染几率最高,对此细菌呈一定聚集度,药物敏感试验结果更易出现多重耐药性,可能与本菌对人体的感染致病机制有关,也与这两个感染部位基础疾病对相关抗菌药物高耐受有一定的关系。应根据相关感染部位的分布特点及耐药情况有针对性地做好防控策略,对预防治疗呼吸道、泌尿道、消化道及伤口感染等进行合理用药。

研究显示,将左氧氟沙星、阿米卡星与 EDTA联合治疗肺炎克雷伯菌感染,治疗有效率高,加用 EDTA使细菌MIC降低,对抗菌药物的敏感性恢复[14]。本研究结果与上述报道结果相一致,不同浓度的EDTA能够降低多重耐药肺炎克雷伯菌对哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星与左旋氧氟沙星抗菌药物的MIC,恢复敏感性。中浓度以及高浓度EDTA能够显著降低MIC。在敏感性试验中,EDTA的抗菌作用已被证实有效,包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、酵母菌等[15]。细菌细胞膜、外膜上有亲水性蛋白通道,允许通过亲水性物质,有利于亲水性药物(如阿米卡星、左旋氧氟沙星)进入。针对细菌的外排泵作用,EDTA可以与Ca2+、Mg2+等维持膜结构、功能的成分络合,导致细胞通透性、流动性增加。药物浓度增加可以对抗降低的外膜渗透性以及药物外排泵出增强导致的多种耐药[16]。研究表明,EDTA对菌膜生长的抑制作用具有浓度差异,并且不同成分的EDTA、不同给药方法对菌膜的抑制作用也存在差异性,EDTA通过破坏菌膜结构加强抗菌药物的临床疗效。根据EDTA能恢复多重耐药肺炎克雷伯菌对抗菌药物的敏感性,明确基本控制策略,降低多重耐药肺炎克雷伯菌感染的发生率,并为临床治疗提供重要依据,为治疗多重耐药菌开发新途径。合理应用抗菌药物,有利于提高患者生存质量,节省医疗费用,减轻患者家庭负担[17-18]。

综上所述,中、高浓度的EDTA能恢复多重耐药肺炎克雷伯菌对哌拉西林他唑巴坦、阿米卡星与左旋氧氟沙星抗菌药物的敏感性,为治疗产ESBLs多重耐药肺炎克雷伯菌及研发新药提供了可借鉴的方向。