微小核糖核酸-29b通过靶向髓样细胞白血病-1影响脑缺血/再灌注损伤时神经细胞凋亡

陈 浩， 黄 智， 张 帅， 王黎洲， 周 石

缺血性脑卒中是全球最严重的神经系统疾病之一，现阶段除了早期溶栓、取栓等介入治疗外，尚无其他更有效的治疗手段。然而介入治疗后血管再通的同时，可能发生脑缺血/再灌注（I/R）损伤［1-3］，是影响脑卒中预后的重要环节。因此寻找新的有效措施预防脑I/R损伤具有重要意义。微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）是通过靶向调节信使RNA（mRNA）稳定性和/或转化效率执行转录和转录后负调控功能的小片段（18～25 nt）单链非编码RNA分子［4］。研究证实最成熟的miRNA通过结合3’非编码区改变靶向mRNA降解或翻译［5-6］。既往研究显示miR-29b、miR-21、miR-200和miR-497似可作为潜在治疗靶点，通过改变大脑皮层中通常高表达的关键信号元件参与脑I/R损伤［7］。miR-29b也可能负调控B淋巴细胞瘤（BCL）-2家族成员，如BCL-W（BCL-2L2）和髓样细胞白血病（MCL）-1等促生存蛋白。这些蛋白是脑I/R损伤的重要调节因子，其作用机制尚不清楚［8-10］。本研究旨在确定miR-29b是否对体外脑I/R损伤具有保护作用，并探讨其潜在作用机制，以期为改善其临床疗效提供新策略。

1 材料与方法

1.1 实验细胞和主要试剂

小鼠成神经细胞瘤（N2a）细胞（中国科学院上海分院），miR-29b模拟物、抑制剂及相应对照组序列（广州锐博生物科技公司），LipofectamineTM 3000试剂（美国Invitrogen公司），细胞计数试剂盒（CCK）-8（日本同仁化学研究所），膜联蛋白（annexin）Ⅴ/碘化丙啶（PI）凋亡试剂盒（杭州联科生物科技公司），TRIzol试剂（美国Thermo Fisher公司），抗小鼠多克隆MCL-1抗体（1∶2 000）（美国Sigma公司），抗小鼠多克隆BCL-2抗体（1∶1 000）、抗小鼠多克隆半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（caspase）-3抗体（1∶1 000）（英国Abcam公司），抗小鼠多克隆3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体（1∶1 000）（美国Santa Cruz生物技术公司），化学发光试剂（美国Merck Millipore公司），psiCheckTM2载体（美国Invitrogen公司），限制性内切酶（生工生物工程上海公司），7500 Fast实时聚合酶链反应（PCR）系统PCR仪（美国Thermo Fisher公司），KO-PLUS诱变试剂盒（美国Santa Cruz生物技术公司）。

1.2 氧糖剥夺/复氧模型建立和实验分组

37℃、5%CO2、95%O2湿润空气条件下，N2a细胞置于加入10%胎牛血清（美国Hyclone公司）和1%青霉素/链霉素（美国Mediatech公司）的高糖Dulbecco改良伊格尔培养基（DMEM）（美国HyClone公司）中培养；N2a细胞置于脱氧无糖DMEM（美国HyClone公司）进行氧糖剥夺（OGD）处理，缺氧条件（5%CO2、1%O2、94%N2）下培养4 h；置于含葡萄糖DMEM，正常培养条件（5%CO2、95%O2）下于12 h进行复氧（R）处理。体外OGD/R模型建立并分为6组：空白对照组（control）、OGD/R组（OGD/R）、OGD/R＋转染miR-29b模拟物组（mimics）、OGD/R＋转染miR-29b抑制剂组（inhibitor）、OGD/R＋转染miR-29b模拟物阴性对照组（mimics NC）、OGD/R＋转染miR-29b抑制剂阴性对照组（inhibitor NC）。

1.3 miRNA模拟转染和实验分组

miR-29b模拟物、miR-29b抑制剂、模拟物NC、抑制剂NC引物序列见表1。按2×105细胞将miR-29b模拟各组N2a细胞培养于6孔板中，分别用LipofectamineTM3000试剂转染200μL成熟miR-29b模拟物、miR-29b抑制剂、模拟物NC、抑制剂NC 24 h，并相应分为4组。

表1 miRNA引物序列

1.4 细胞活力检测

上述4组序列转染后，在96孔板每孔中加入100μL CCK-8溶液，培养箱中孵育1 h；酶标仪测量450 nm处吸光度。

1.5 细胞凋亡检测

采用annexinⅤ/PI凋亡试剂盒定量检测凋亡细胞。收集4组N2a细胞，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗，置于含5μL annexinⅤ（10 g/mL）的200μL结合缓冲液中重新悬浮，暗室中静置10 min；置于10μL PI（20 g/mL）中孵育；流式细胞仪（美国Beckman公司）检测细胞凋亡，CellQuestTM软件（美国BDBiosciences公司）进行数据采集和分析。

1.6 蛋白分离和免疫印迹分析

常规方法对4组样本2×l06N2a细胞裂解后，提取总蛋白，进行免疫印迹分析。主要抗体为抗小鼠多克隆MCL-1抗体（1∶20 000）、BCL-2抗体（1∶1 000）、caspase-3抗体（1∶1 000）、GAPDH抗体（1∶1 000）。采用化学发光试剂和LAS4000发光成像分析仪（美国GE Healthcare公司）观察蛋白印迹。

1.7 实时定量PCR检测

根据TRIzol试剂使用说明，从细胞中提取总RNA，NanoDrop 1000分光光度计（美国Thermo Fisher公司）进行RNA定量；根据Bestar qPCR RT试剂盒（德国DBI Bioscience公司）使用说明，对每个样本1μg总RNA行逆转录，96孔板和7500 Fast PCR仪行实时定量PCR检测。每20μL PCR反应体系包括1μL逆转录产物（1∶5）、0.5μL有义引物、0.5μL通用逆转录引物、10μL混合缓冲液（Bestar Sybr-Green qPCR master mix），加双蒸水至20μL。反应条件为94℃，反应2 min，94℃和58℃循环20 s，循环40次，72℃反应20 s，所有反应重复3次。引物序列见表2。

表2 miR-29b引物序列

1.8 重组质粒结构和双荧光素酶检测

从GenBank数据库中检索小鼠MCL-1 mRNA（NM_000286）3'非翻译区（UTR）并应用合成引物：MCL-1正向5'GCTAGCCGCTACTAGGCTCCCC3'，反向5'CGGGTAGTATATACGCGTCGTTAC3'扩增。将产物克隆至psiCheckTM2载体，重组载体扩增至重组大肠杆菌DH5α，并用无内毒素质粒纯化试剂盒纯化。每片段分别用Takara LA Taq（日本TaKaRa生物公司）PCR扩增并克隆至载体。采用KO-PLUS诱变试剂盒使MCL-1 3'UTR序列中miR-29b结合位点突变。所有构建物均经限制性内切酶（上海生工生物工程公司）消化测序。

N2a细胞在6孔板上接种密度为1.0×105细胞/mL，次日可达到50%覆盖。miR-29b转染24 h，用上述LipofectamineTM3000转染psiCheckTM2-MCL-1-3'UTR-wt/-mut质粒（美国Invitrogen公司），再孵育24 h；收集细胞，测定荧光素酶活性，通过双荧光素酶报告器（美国Promega公司）和微孔板阅读器（美国Biotek公司）标准化荧光素酶活性。处理后的细胞样本与对照细胞样本的发光率，均给予3个独立样本转染的均值±标准差。

1.9 数据分析

实时定量PCR数据分析中，以相对定量法测定目标miRNA表达量变化。用U6 RNA对表达进行标准化，并测定扩增后变化。每个样本折叠变化用2-ΔΔCq表达式计算法，ΔΔCq＝（Cq目标基因-CqU6）PIH-（Cq目标基因-CqU6）对照。值2-ΔΔCq＞1.5或＜0.67考虑miRNA差异表达。t检验评估实时定量PCR检测的miRNA表达差异。采用SPSS 17.0软件分析其他实验数据。各组间miRNA log10转换相对数量比较用单因素方差分析，其基因间差异评价用Post-Hoc检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-29b与MCL-1相互作用

双荧光素酶实验显示，与psiCheckTM2-MCL-1-3'UTR-mut转染细胞相比，miR-29b模拟物和psiCheckTM2-MCL-1-3'UTR-wt处理后N2a细胞中荧光素酶活性降低（图1）；结果表明miR-29b通过与MCL-1的3'UTR端结合下调MCL-1表达。

图1 N2a细胞中转染miR-29b模拟物与MCL-1 3'UTR端潜在miR-29b结合片段的相互作用

2.2 miR-29b模拟物和抑制剂在N2a细胞中的作用

转染24 h后，OGD/R组miR-29b水平与control组相比明显升高，mimics组升高更明显，inhibitor组升高不明显（图2）。

2.3 miR-29b模拟物和抑制剂对细胞活力的影响

OGD/R组细胞存活率与control组相比明显降低，mimics组降低更加明显（P＜0.01），inhibitor组与control组无明显差别；表明OGD/R环境下miR-29b模拟物抑制N2a细胞活力，miR-29b抑制剂促进N2a细胞存活（图3）。

图2 miR-29b模拟物和抑制剂在N2a细胞中的作用

2.4 miR-29b模拟物和抑制剂对细胞凋亡的影响

mimics组细胞凋亡发生与control组相比显著升高，inhibitor组与mimics组相比细胞凋亡较少（图4）；表明OGD/R环境下miR-29b模拟物促进神经细胞凋亡，miR-29b抑制剂抑制神经细胞凋亡。

图3 miR-29b模拟物和抑制剂对N2a细胞活力的影响

图4 miR-29b模拟物和抑制剂对细胞凋亡的影响

2.5 miR-29b模拟物和抑制剂对凋亡蛋白的影响

OGD/R组细胞中BCL-2、MCL-1表达水平与control组相比均明显下调，caspase-3明显上调，mimics组BCL-2、MCL-1表达进一步受抑，但在inhibitor组明显上调，caspase-3表达明显下调；表明OGD/R环境下miR-29b下调MCL-1、BCL-2表达，同时上调caspase-3表达（图5）。

3 讨论

研究表明脑I/R损伤是影响脑卒中预后的重要环节，OGD/R环境下神经细胞凋亡明显增加［11-12］。本实验研究结果与之一致。然而OGD/R环境下神经细胞凋亡机制不甚明确［12］。许多研究表明，miRNA在脑I/R损伤中起关键作用［13-14］。miR-29b是否有促进细胞凋亡的作用尚不明确［15］。本研究结果表明，脑I/R过程中miR-29b表达明显升高，且下调抗凋亡蛋白MCL-1、BCL-2表达，上调凋亡蛋白caspase-3表达，促进神经细胞凋亡，但miR-29b促进神经细胞凋亡的具体机制仍不清楚。miR-29b可直接与MCL-1 3’UTR端结合下调MCL-1表达，因此推断miR-29b通过靶向下调MCL-1表达促进脑I/R时神经细胞凋亡。

图5 miR-29b模拟物和抑制物对N2a细胞凋亡相关蛋白的影响

以往大量研究关注miR-29b对肿瘤的调控作用。然而miR-29b在OGD/R环境下和脑I/R损伤患者神经细胞中也显著上调［7，16］。有研究显示，激活的miR-29b在神经元成熟过程中通过靶向BH3蛋白表达促进神经细胞凋亡［17］。本实验研究表明miR-29可与MCL-1蛋白3'UTR端结合，这与既往研究结果一致。BCL-2家族可分为抗凋亡因子或促凋亡因子，它们通过改变线粒体膜完整性和功能发挥作用，也影响凋亡信号转导通路。BCL-2家族由3个亚群组成：①促生存蛋白，如BCL-2、BCL-xl（BCL-2L1）、BCL-w（BCL-2L2）、MCL-1和A1；②多域促凋亡蛋白，如BAX和BAK；③BH3域促凋亡蛋白，如BIM、PUMA（BBC3）、BID、BAD、BIK、BMF、HRK和NOXA（PMAIP1）［18-20］。MCL-1是BCL-2家族中重要的抗凋亡蛋白，抑制MCL-1可通过线粒体途径促进细胞死亡；MCL-1还参与脑I/R损伤过程中神经细胞凋亡［21］。因此，本研究考虑miR-29b与MCL-1间相互作用，是神经细胞凋亡过程中关键因素之一。Shi等［22］研究也表明，一些miRNA直接针对BCL-2家族蛋白3'UTR端，如miR-15b在永久性大脑中动脉闭塞（MCAO）后高表达，可能直接针对BCL-2。miR-491-5p也被认为可结合BCL-xl（BCL-2L1）mRNA，这是BCL-2家族中抗凋亡成员之一［23］。此外，miR-29b上调通过抑制缺血后脑损伤BCL-2L2蛋白促进神经元细胞凋亡［24］。许多化疗药物通过下调肿瘤细胞中MCL-1表达诱导细胞凋亡，本中心既往研究结果表明靶向miR-29b也可能通过抑制MCL-1表达成为脑I/R损伤的治疗靶点［25］。本研究再次证实该结果。

本研究在蛋白质和组织学水平证实本中心最初假设，即miR-29b通过靶向MCL-1促进脑I/R损伤过程中神经细胞凋亡。然而本研究也有一定局限性，如实验数据是在体外环境中应用miR-29b模拟物所获得，可能不能准确反映体内效应。本中心计划在MCAO动物模型中进一步实验探索脑I/R损伤与miR-29b抑制剂或MCL-1过表达间的治疗关系。此外，需要进一步实验验证miR-29b在脑I/R损伤中靶向MCL-1的神经损伤和神经保护作用，探讨miR-29b在脑I/R损伤时神经元细胞中的功能和机制，以期为缺血性脑卒中患者开发出新的治疗靶点。