右美托咪定对七氟醚致老年小鼠脑组织炎性反应的影响

汤娜娜，李 娟，李 军，曹福羊

术后认知功能障碍是围手术期常见并发症，可表现为患者记忆力、注意力或执行能力的改变[1]。研究表明全身麻醉与术后神经系统功能障碍存在相关联系[2]。七氟醚是一种常用的全身麻醉剂，可诱导神经系统炎性反应和凋亡，这些病理生理反应均与认知功能障碍的发生密切相关[3-4]。右美托咪定是一种效果确切的麻醉辅助用药，其具有镇静、抑制交感活性、抗炎、抗凋亡和抗神经兴奋毒性等优点[5-6]。有研究证实，右美托咪定可抑制多种因素导致的脑组织炎性反应，如脓毒症导致大鼠脑组织炎性反应[7]、大鼠全脑缺血再灌注损伤导致的炎性反应[8]、高氧导致的新生大鼠脑损伤等[9]。但是关于右美托咪定对七氟醚导致的脑组织炎性反应的直接作用少有报道。因此本研究拟探讨右美托咪定预处理对七氟醚吸入麻醉后的老年小鼠脑组织炎性反应的影响。

1 材料与方法

C57BL/6J 雄性小鼠共126 只，12 月龄，由北京华阜康生物工程有限公司提供。采用随机数字表法分为3 组：对照组（Con 组）、七氟醚组（Sevo 组）、七氟醚+右美托咪定组（Sevo+Dex 组）。将小鼠置于标准饲养环境（室温18～22℃，自然昼夜光线照明），自由进食进水。

1.1 模型制备及治疗 Sevo+Dex 组小鼠在吸入七氟醚前30 min腹腔缓慢注射右美托咪定（江苏恒瑞医药股份有限公司）25 ug/kg，而Con 组和Sevo 组小鼠腹腔注射同等容量生理盐水作为对照。Sevo 组和Sevo+Dex 组小鼠置自制密闭树脂盒麻醉处理2 h，通过气体流量计将3%七氟醚和33% O2混合加湿后从入气口输入树脂箱内，麻醉气体监测仪（德尔格医疗设备有限公司，德国）监测七氟醚及O2浓度。应用小鼠遥测系统对小鼠血压、脉氧、心电进行实时监测。Con 组小鼠则置于相同环境，连续吸入33%O22 h。

1.2 伊文氏蓝和脑组织含水量的测定 于造模后6、12和24 h时，每组取6只小鼠，尾静脉注射2%伊文氏蓝(Evan's Blue，EB，美国Sigma 公司)3 mL/kg，2 h后麻醉小鼠，于左心室灌注等渗生理盐水，至右心耳流出清亮液体，断头取脑，取左侧皮层组织称重，放入盛有3 mL 甲酰胺的离心管，37 ℃水浴48 h，3000×g 离心15 min，取上清液。采用分光光度计波长632 nm 处检测其吸光度。根据标准曲线计算脑组织EB 含量。取右侧皮层组织，滤纸吸干多余水分，称湿重，放入烘箱内烘烤（80℃，48 h）至恒重，取出后称干重，计算脑组织含水量，即脑组织含水量=[(湿重－干重)/湿重×100%]。

1.3 酶联免疫吸附实验（ELISA）检测TNF-α 和HMGB1的水平 于造模后6、12和24 h时，各组取6只小鼠，麻醉后处死小鼠，经左心室灌注等渗生理盐水，取皮层组织，研磨匀浆后，4℃下10 000×g离心10 min，取上清液。采用酶联免疫吸附试验试剂盒（ELISA）法（美国R＆D 公司）检测脑组织TNF-α和高迁移率族蛋白B1（High Mobility Group Box 1，HMGB1）的水平。

1.4 TUNEL 染色检测皮层细胞凋亡情况 于造模后24 h 时，各组取6 只小鼠，取脑组织方法同上，10%多聚甲醛固定6 h，制备成石蜡切片。参考TUNEL 凋亡试剂盒进行实验（瑞士Roche 公司）。在光学显微镜下（200 倍）观察并分析。每个标本随机选取3 张切片，每个切片取3 个不同视野进行观察，皮层组织细胞核圆，呈淡蓝色，而凋亡细胞的细胞核固缩，呈棕黄色，计算凋亡细胞数及凋亡指数（凋亡细胞数/有核细胞总数×100%）。

1.5 统计学分析 采用SPSS 21.0 统计学软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用非配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠皮层组织EB 含量和含水量的比较与Con 组比较，造模后6、12 和24 h 时，Sevo 组和Sevo+Dex组小鼠皮层组织EB含量和含水量明显增加(P<0.05)。与Sevo组比较，造模后6、12和24 h时Sevo+Dex 组皮层组织EB 含量和含水量降低（P<0.05），表1。

表1 各组小鼠造模后6、12和24 h时皮层组织EB含量和含水量的比较（n=6，）

表1 各组小鼠造模后6、12和24 h时皮层组织EB含量和含水量的比较（n=6，）

与Con组比较，*P<0.05 与Sevo组比较，#P<0.05

2.2 各组小鼠皮层组织炎症因子TNF-α和HMGB1水平的比较 与Con组比较，造模后6、12和24 h时，Sevo 组 和Sevo+Dex组小鼠皮层组织TNF-α 和HMGB1水平明显增加(P<0.05)。与Sevo组比较，造模后6、12和24 h时Sevo+Dex组皮层组织TNF-α和HMGB1水平明显降低（P<0.05），表2。

表2 各组小鼠造模后6、12和24 h时脑组织TNF-α和HMGB1的比较（n=6，）

表2 各组小鼠造模后6、12和24 h时脑组织TNF-α和HMGB1的比较（n=6，）

与Con组比较，*P<0.05 与Sevo组比较，#P<0.05

2.3 各组小鼠皮层组织细胞凋亡情况的比较 于造模后24 h，Con 组小鼠皮层可见少量细胞凋亡。与Con 组比较，造模后24 h 时，Sevo 组和Sevo+Dex组小鼠皮层凋亡细胞明显增多(P<0.05)。与Sevo组比较，造模后24 h 时Sevo+Dex 组皮层组织凋亡细胞明显减少（P<0.05），图1，表3。

图1 各组小鼠皮层细胞凋亡情况的比较

表3 各组小鼠皮层组织细胞凋亡指数的比较（n=6，）

表3 各组小鼠皮层组织细胞凋亡指数的比较（n=6，）

与Con组比较，*P<0.05 与Sevo组比较，#P<0.05

3 讨论

研究表明连续吸入3%七氟醚2 h 可导致大鼠认知功能障碍，可能与上调海马TNF-α、IL-6、IL-8和Caspase-3的表达,激活神经系统炎性通路和凋亡通路有关[9]。因此本实验采用此方法诱导老年小鼠脑组织产生炎性反应。

目前，术后认知功能障碍发病机制尚不清楚，但是神经炎性机制是最重要的理论之一。炎症因子和趋化因子（TNF-α、IL-1β、HMGB1）等的合成和释放，可破坏血脑屏障的通透性，血脑屏障破坏后可使大量有害物质进入中枢神经系统，导致中枢神经系功能障碍，此时EB 便可大量通过血脑屏障进入脑组织[10-11]。本实验结果显示，与Con 组比较，Sevo组小鼠造模后6、12和24 h皮层组织EB含量和含水量升高，且24 h 皮层细胞凋亡明显增多，表明小鼠血脑屏障受到破坏，神经系统产生炎性反应。

右美托咪定是一种高选择性的α2 肾上腺素能受体激动剂。被广泛地应用于镇静、麻醉性镇痛、抗焦虑。围手术期给予右美托咪定治疗可显著降低术后炎性反应和认知功能障碍的发生[12]。研究发现25 ug/kg右美托咪定预处理可明显改善七氟醚诱导的新生大鼠远期认知功能障碍[13]。同时，右美托咪定还可通过减少脑组织神经元凋亡来改善阿尔茨海默症小鼠认知功能障碍[14]。本实验发现，右美托咪定预处理减少了小鼠吸入七氟醚后，其6、12和24 h 脑组织EB 含量和含水量，且24 h 皮层组织细胞凋亡明显减少，提示右美托咪定可减轻七氟醚诱导的老年小鼠血脑屏障的破坏，减少细胞凋亡。

大量证据表明吸入麻醉药与认知功能障碍存在一定的联系且与激活神经系统炎性反应相关[15]。Chen等[16]研究发现，右美托咪定可改善肝部分切除小鼠术后认知功能障碍，可能与抑制小胶质细胞活化，下调NF-κB通路，降低海马组织TNF-α和IL-1β的水平有关。本实验结果表明，老年小鼠吸入3%七氟醚2 h 可显著增加皮层组织炎症因子（TNF-α和HMGB1）的水平，提示七氟醚可导致神经系统炎性反应。给予右美托咪定预处理后，Sevo+Dex组小鼠皮层组织炎症因子（TNF-α 和HMGB1）的水平较Sevo组明显降低，证明预先给予右美托咪定腹腔注射可减轻因吸入七氟醚导致的神经系统炎症。

综上所述，右美托咪定可减轻七氟醚诱导的老年小鼠神经系统炎症和血脑屏障的破坏、脑组织细胞凋亡。为将来进一步研究右美托咪定是否能减轻吸入麻醉药导致的认知功能障碍及其作用机制奠定了基础。