Rab10通过介导肝癌细胞上皮间质转化促进肝癌转移

高明萱，雍遇乐，刘泽昆，陆蒙

肝癌在全球恶性肿瘤中发病率排名第七，死亡率排名第四，从全球来看，我国肝癌的发病率和致死率都居于世界首列[1]，其中肝细胞癌（Hepatocel‐lular Carcinoma,HCC）是最主要的肝癌类型，由于其高复发、高转移，患者接受治疗的5 年生存率较低[2]，因此，研究肝癌转移的潜在机制，对于预防HCC 患者转移的发生、制定晚期HCC 患者的治疗策略均具有重要意义。

Rab10 是小分子GTP 酶家族的成员，具有GDP和GTP 结合域，主要参与蛋白的囊泡运输[3-4]。Rab10的表达和活化均会影响蛋白和脂质的合成与转运。研究发现，活化的Rab10 破坏VSVG 到达细胞基底侧膜的定位分选，使其部分位于顶端膜[5]。在上皮细胞早期极化过程中，Rab10 从高尔基体运输开始发挥作用，并与Rab8 合作参与蛋白质向基底侧膜的转运[5]。此外，Rab10蛋白作为Ras家族成员，参与肿瘤发生和进展。例如，长链非编码RNA LINC00152通过miR-107/Rab10调控食管鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭[6]。MiR-329 通过下调Rab10抑制骨肉瘤的发展[7]。在HCC 中，Rab10 过表达通过多种致癌、细胞应激和细胞凋亡途径来调节细胞存活和增殖，最终促进肿瘤发生[8]。MicroRNA-519d/Rab10 可通过激活AMPK 通路诱导肝癌细胞自噬和凋亡[9]。尽管最近的研究表明Rab10 的表达与肝癌细胞的增殖和凋亡密切相关，然而，关于Rab10在肝癌转移中的作用目前尚无报道。

本研究将探讨Rab10 表达对肝癌迁移和侵袭的影响。首先，通过对美国癌症基因组图谱（Can‐cer Genome Atlas，TCGA）和基因表达汇编（Gene Expression Omnibus，GEO）两个肿瘤数据库的分析发现Rab10 mRNA 在HCC 患者中高表达，并且Rab10 的表达与肝癌病人生存密切相关。然后，利用特异靶向Rab10 的小RNA 干涉片段，明确干涉Rab10 可通过调控上皮间质转化（Epithelial-Mes‐enchymal Transition，EMT）来降低HCC 细胞的迁移和侵袭。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞系HCC-LM3细胞购于上中国科学院上海生科院细胞资源中心，E-cadherin、N-cadherin 和Snail 抗体购于武汉三鹰生物有限公司，Rab10 多克隆抗体购于Abcam 公司，α-tubulin单克隆抗体为空军军医大学细胞生物学教研室制备，转化生长因子-β1(Transforming Growth Factorβ1,TGF-β1）购于美国Peprotech 公司。DMEM 培养基、细胞消化液、谷氨酰胺、青链霉素均购于美国Invitrogen 公司，胎牛血清购自于杭州四季青公司，Rab10 干涉与对照片段购于上海吉玛基因公司，LipofectamineTM 2000 转染试剂购于美国Invitrogen公司，细胞裂解液RIPA 与PMSF 购于上海碧云天生物技术公司，二辛可宁酸（Bicinchoninic Acid，BCA）蛋白定量试剂盒购于英国Pierce 公司，发光液EnlightTM 购于北京英格恩生物科技有限公司。实时荧光定量聚合酶链反应（Real-Time fluores‐cence Quantitative Polymerase Chain Reaction，RTqPCR）所用试剂盒为反转录试剂盒和SYBR Pre‐mix Ex TaqTM 购于大连宝生物工程公司，主要仪器Real-time PCR 仪购自美国Agilent 公司，电泳仪与电泳槽、发光仪、流式细胞仪均购自美国BD 公司，酶联免疫检测仪购自美国BioTek 公司、倒置显微镜购自日本Nikon 公司，Image Station 4000 MM Pro和XLS180 光信号采集系统为美国Kodak公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 人肝癌细胞系HCC-LM3用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，培养于温度37 ℃，5% C02浓度，饱和湿度的培养箱中，隔天换液。细胞转染时取对数生长期的HCC-LM3细胞悬液接种于6 孔板中，培养至细胞密度70%后进行转染，转染步骤及剂量严格按照LipofectamineTM 2000转染说明书步骤，分别用设计的Rab10特异性小干扰RNA（Small Interfering RNA，SiRNA）片段和阴性对照片段（表1）来实现Rab10的下调表达。

1.2.2 分组 按照Rab10 干涉情况可分为Si-Rab-1,Si-Rab-2,Si-Rab-3 组和阴性对照组（Negative Control,NC）。按照处理因素可分为4 组，空白对照组（不加TGF-β1），TGF-β1 刺激组（加入5 ng/ml TGF-β1 刺激24h），TGFβ1+NC组（在阳性对照组加入5 ng/ml TGF-β1）和TGF-β1+Si-Rab10-3 组（在干涉Rab10组加入5 ng/ml TGF-β1）。

1.2.3 蛋白提取与Western Blot HCC-LM3细胞于转染48 h 后，加入TGF-β1（5 ng/mL），24 h 收集细胞，用RIPA 裂解缓冲液裂解细胞，4 ℃裂解30 min,13000 rcf 离心30 min,提取细胞总蛋白，用BCA 法进行蛋白定量，用10%SDS-PAGE凝胶进行蛋白电泳，转膜，孵育一抗Rab10（1：300）、E-cadherin（1：1500）、N-cadherin（1：1500）、Snail（1：500）和αtubulin（1：50）,4 ℃过夜孵育，用TBST 缓冲液洗去一抗，滴加同种属二抗室温孵育1 h，再用TBST 缓冲液洗去二抗，用化学发光液进行发光。

1.2.4 RNA 提取和RT-qPCR 依照RNA 提取试剂盒说明书提取HCC-LM3 的RNA，并将其反转合成为cDNA。使用Primer Blast 进行引物设计，序列如下，Rab10：上游引物5’-CTGCTCCTGATC‐GGGGATTC-3’，下游引物5’-TGATGGTGT‐GAAATCGCTCCT -3’;GAPDH:上游引物5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC -3’，下游引物5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA -3’。使用SYBR Premix Ex TaqTM，配制20 μL反应体系：SYBR 10 μL；Primer Forward 0.8 μL；Primer Reverse 0.8 μL；cDNA 2 μL；DEPC H2O 6.4 μL，将反应体系加入八连管中，混匀后离心，放入实时定量PCR仪中。

1.2.5 基质胶侵袭实验与迁移实验 在24 孔板中预先铺设Transwell 小室，对于侵袭实验，提前加入用培养基稀释好的Matrigel稀释液（1:5）100 μL，置于37 ℃培养箱3 h,使Matrigel 胶凝固，迁移实验直接铺设Transwell小室。准备转染48 h的HCC-LM3细胞，TGF-β1（5 ng/mL）刺激24 h 后，消化、离心用无血清培养基重悬，细胞计数约1×105个/mL。取细胞悬液加入小室，上室每孔加200 μL 的细胞悬液，下室加入含10%胎牛血清的DMEM 培养基500 μL，继续培养。再培养18 h 后，取出Transwell 小室，用0.2%结晶紫/95%乙醇固定染色，清水中涮洗，再用干净的棉签去除上层的细胞，风干过夜后进行拍照计数。每组实验重复3次，取均值。

1.3 统计学处理 通过SPSS16.0 分析软件，采用Kaplan-meier 法进行总生存时间分析。计量资料采用“均数±标准差（）”表示，统计分析用Graphpad prism 软件，组间比较采取t检验，P<0.05为存在显著差异。

2 结果

2.1 临床HCC组织中，Rab10表达与预后的相关性分析 为了明确Rab10 在HCC 患者组织中的表达，我们通过TCGA-LIHC 数据库和GEO 数据库（GSE22058），首先分析了Rab10 的mRNA 表达，其中，TCGA-LIHC 数据库包括371 例原发性肝癌肿瘤和50 例非肿瘤癌旁组织，GEO 数据库包括96 例原发性肝癌肿瘤和相对应的癌旁组织。TCGALIHC 和GEO 数据分析显示，癌旁组织中Rab10 的mRNA水平显著低于HCC组织，差异具有统计学意义（图1A）。接着，对TCGA-LIHC 的肝癌病人进行总体生存分析，结果表明Rab10高表达的HCC患者生存率低（P<0.0001，图1B）。

图1 Rab10对临床预后的影响

2.2 Rab10 对肝癌细胞迁移和侵袭能力的影响Western Blot 和RT-qPCR 结果显示，与阴性对照组（Negative Control，NC）比较，siRab10-3 组中Rab10蛋白和mRNA 水平显著降低（图2A，图2B）。接下来，利用此干涉片段和NC组进行细胞功能实验，迁移实验显示，穿过小室的NC 组细胞数为194.30±5.78，与对照组比较，干涉Rab10 组细胞穿过数目为68.67±12.81，干涉Rab10降低了HCC-LM3细胞的迁移能力（P=0.0009，图2C）。同时，细胞侵袭实验显示，干涉Rab10 降低了HCC-LM3 细胞的侵袭能力（P=0.0139），其中NC 组和Si-Rab10-3 组穿过小室的细胞数分别为139.3±16.59 和64.00±7.02（图2D）。

图2 两组细胞迁移和侵袭能力的比较

2.3 Rab10 对TGF-β1 诱导的肝癌细胞EMT 的影响 Western Blot结果显示，在HCC-LM3细胞中，与对照组比较，干涉Rab10 后E-cadherin 表达上调，同时N-cadherin 和Snail 表达下调(图3A)。TGF-β 1 刺激后，E-cadherin 表达下调，N-cadherin 和Snail表达上调，而相比于NC 组，干涉Rab10 则升高Ecadherin 的表达，降低N-cadherin 和Snail 的表达，即干涉Rab10 抑制了由TGF-β1 引起的E-cadherin下降和N-cadherin、Snail 表达的升高（图3B）。TGF-β1 诱导肝癌细胞EMT 的过程中，肝癌细胞的迁移和侵袭能力增强，Transwell迁移和侵袭实验也证实此结论，与空白对照组（细胞迁移数为216.30±5.55；细胞侵袭数为211.00±17.78）比较，TGF-β1 组可明显增强HCC-LM3 细胞的迁移（细胞迁移数为531.00±3.79，P<0.0001）和侵袭能力（细胞侵袭数为448.70±24.22，P=0.0014）。然而，TGF-β1 刺激下，与NC 组相比（细胞迁移数为533.30±4.37；细胞侵袭数为480.70±4.06），干涉Rab10 后肝癌细胞的迁移（细胞迁移数为166.30±8.01，P<0.0001）和侵袭能力降低（细胞侵袭数为125.70±12.13，P<0.0001，图3C）。

图3 Rab10对肝癌细胞EMT的作用

3 讨论

Rab GTP 酶可作为细胞膜系统的核心调控因子，在生理状态下，维持胞内蛋白的转运，膜性结构的转运和细胞骨架的稳定。当转运功能障碍时，可导致机体出现从感染性疾病到癌症不等的多种疾病状态[10]。尤其值得注意的是，作为一个转运相关分子，近些年越来越多的报道指出Rab10在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥着重要作用[11-12]。目前，Rab10在HCC 中研究仍处于初级阶段，在肝癌发生阶段的增殖和凋亡方面少有报道，而对于该蛋白在肝癌进展中的作用未有研究。因此，我们将关注点放在了Rab10 在HCC 转移中的作用。首先，通过TCGA-LIHC 和GEO 两个癌症相关数据库的分析发现与癌旁组织相比，Rab10 在HCC 组织中mRNA显著高表达。然后，通过与肝癌转移相关的细胞功能实验证实，干涉Rab10显著降低HCC细胞的侵袭和迁移能力。综上，Rab10 不仅在肝癌的形成和增殖方面发挥了重要作用，该蛋白在肝癌转移方面的作用也不可忽视。

通常EMT 的发生被认为是转移的启动子，是肿瘤细胞迁移和侵袭的重要步骤[13]，具有极性的上皮细胞转化为间质细胞，并获得侵袭和转移能力。经历EMT 的细胞，其形态和功能都会发生改变，丧失顶端-基底极性和细胞-细胞间的连接，既可以穿透基底膜和间质组织，还可以穿过循环系统至远处组织[14-15]。那么，Rab10 对肝癌细胞的迁移和侵袭是否是通过EMT 呢？于是，我们检测了干涉Rab10后对上皮细胞标志物E-cadherin和间质细胞标志物N-cadhein、Snail 表达的影响，结果显示，HCC-LM3 细胞中，下调Rab10 后，E-cadherin 表达上调，N-cadherin和Snail表达下调。

TGF-β1是公认的EMT诱导因子，在HCC发生和发展中发挥着重要的作用，其可以通过与细胞膜上的受体结合，激活Smad 通路（Smad2、Smad3 和Smad4），最终促进EMT 的形成[16-18]。另外，TGF-β1可以破坏上皮细胞极性和细胞连接，诱导癌细胞发生EMT，促进肿瘤的转移，其中包括E-cadherin、Ncadherin、Snail、Twist 等分子表达的改变[19-21]。为了更加明确Rab10表达与EMT的相关性，我们建立了TGF-β1 诱导的肝癌细胞EMT 模型，本研究通过Western Blot 发现，降低Rab10 的表达可以增加TGF-β1 下调的上皮标志物E-cadherin 蛋白表达，降低TGF-β1上调的间质标志物N-cadherin和Snail蛋白表达。进一步功能实验证实，干涉Rab10抑制了TGF-β1 引起的肝癌细胞的迁移和侵袭，总之，Rab10 的表达会影响肝癌细胞发生EMT 进而调控肝癌进展。这些结果表明：干涉Rab10 可抑制由TGF-β1增强的HCC-LM3细胞的迁移和侵袭能力，即Rab10可通过EMT调控肝癌细胞的迁移和侵袭。

综上所述，我们的研究发现癌基因Rab10 可通过介导EMT 影响HCC 的恶性进展。这样，Rab10可作为一个潜在的肝癌晚期标志物，靶向Rab10可能成为一种新的针对晚期HCC 的治疗策略，对今后肝癌的研究提供新理论和新思路。然而，我们只揭示了Rab10 在HCC 转移中作用，我们认为，在这一进程中，一定有许多有趣的机制深埋在地下，值得我们进一步探索。