无创产前检测在辅助生殖胎儿非整倍体疾病筛查中的应用评价

余 夏，石明芳，周元圆，梁秀云△

1.广西壮族自治区人民医院精准联合检验中心，广西南宁 530021；2.广西壮族自治区南宁市第二人民医院检验科，广西南宁 530031

有研究发现孕期母体外周血有胎盘游离DNA存在[1]，通过检测孕期母体外周血中游离DNA片段进行各种胎儿染色体疾病的产前筛查和诊断成为备受关注的研究热点。2008年FAN等[2]报道利用大规模平行测序技术对母体外周血中的游离DNA进行深度测序，从而获取胎儿染色体非整倍体信息。之后，该技术广泛应用于临床产前筛查21-三体综合征、18-三体综合征及13-三体综合征[3]。无创产前检测(NIPT)是采集孕妇外周血，提取总游离DNA，通过计数非整倍体胎儿引入的额外染色体，采用高通量测序进行准确检测；计算出胎儿游离DNA相对表达水平，从而筛查出胎儿染色体异常的方法。由于NIPT较传统产前筛查和诊断存在快速、无创、灵敏度和特异度高等优点，成为临床医师与孕妇的普遍选择，尤其是通过体外受精-胚胎移植方式(IVF)受孕的孕妇，在进行染色体非整倍体筛查时更加倾向于选择NIPT。而目前关于NIPT用于辅助生殖胎儿的大样本量数据研究较少，本研究选择2017年12月至2019年2月于南宁市第二人民医院产前诊断中心进行NIPT的IVF孕妇，与自然受孕者比较，进一步评价NIPT在IVF受孕者中的应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年12月至2019年2月于南宁市第二人民医院产前诊断中心进行遗传咨询并签署知情同意行NIPT的孕妇，其中经IVF受孕者418例为IVF组，同期自然受孕者4 944例为对照组。

1.2仪器与试剂 外周血游离DNA提取及文库制备采用北京博奥生物集团有限公司晶芯®胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(半导体测序法)，采用晶芯®BioelectronSeq 4000测序平台进行高通量序列分析，采用晶芯®无创产前数据分析管理软件进行生物信息学分析。染色体核型采集分析采用德国蔡司公司全自动染色体扫描分析系统。

1.3方法 详细记录孕妇的临床资料，包括年龄、孕产史、釆血时孕周、体质量、胎数妊娠方式、既往病史等内容。抽取孕妇外周血10 mL置于DNA保存管中，4 ℃条件下以1 600×g离心15 min，吸取上层血浆保存于2 mL离心管中，吸取白细胞层于1.5 mL离心管中存储。4 ℃条件下以16 000×g离心10 min去除细胞，吸取上清液置于新的1.5 mL离心管中用于检测。对NIPT结果高风险的孕妇经知情同意后抽取羊水，对羊水标本进行细胞培养及染色体制备。回顾性分析IVF孕妇及自然受孕孕妇NIPT、随访和产前诊断结果，分析评价IVF孕妇与自然受孕孕妇的阳性预测值是否存在差异。

2 结 果

2.12组孕妇一般情况比较 IVF组孕妇年龄偏高，2组年龄比较差异有统计学意义(P<0.05)，但2组孕妇体质量比较差异无统计学意义(P>0.05)。IVF组双胎135例，单胎283例，对照组双胎115例，单胎4 829例，IVF组孕妇双胎妊娠比例高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 2组孕妇一般情况比较

2.22组PPV、NPV比较 NIPT筛查结果显示，IVF组21-三体综合征PPV为100%；对照组21-三体综合征PPV为94.1%，18-三体综合征PPV为57.1%，性染色体异常PPV为27.3%，其他染色体异常PPV为17.4%；筛查2组21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征的NPV均为100%。见表2。

表2 2组PPV、NPV比较

3 讨 论

NIPT的分析有效性和临床有效性已得到广泛验证，国内学者根据研究结果明确地将该技术定位于“目标疾病明确，检测效果接近于诊断的产前筛查技术”[4]，与传统筛查方法比较，它以更低的母婴损伤率，大幅提高了胎儿染色体非整倍体检测的准确度，对于产前诊断具有重要意义。

鉴于该技术的发展现状及在我国临床应用的实际情况[5-8]，我国将筛查的目标疾病定位于21-三体综合征、18-三体综合征和13-三体综合征，并结合我国的具体情况规定了适用人群、慎用人群和不适用人群。慎用人群中包括高龄、重度肥胖、有异常胎儿分娩史、多胎妊娠史，以及IVF受孕者。故在采集病史时需完善年龄、孕产史、釆血时孕周、体质量、胎数、妊娠方式、既往病史、不良孕产史等，辨别受试者是否适用NIPT检测，各类高风险因素对结果是否有影响。

目前我国不孕症的发病率约为15%,以IVF为代表的辅助生殖技术是目前治疗不孕症的主要手段之一[8]，尽管胚胎移植前遗传学检测技术不断发展，但针对胚胎移植前未进行胚胎移植遗传学筛查而又不愿行有创检查的孕妇，NIPT筛查染色体非整倍体异常就尤为重要。有研究表明，NIPT在高风险人群筛查中21、18、13-三体综合征的检出率和阳性预测值优于低风险人群[9-10]。本研究IVF组和对照组比较，IVF组孕妇年龄偏高，且孕妇双胎比例明显高于对照组(P<0.05)。随着国家二孩政策的实施，较多高龄孕妇因自然受孕困难故接受IVF方式受孕，故平均年龄高于自然受孕孕妇，也使得其染色体非整倍体的概率较自然受孕孕妇高。多胎妊娠为辅助生殖后的常见情况，双胎妊娠，多数为双卵双胎，它们分别有着独立的遗传物质，从母血中难以区分2个胎儿，导致血清学筛查效率降低。GIL等[11]一项Mata分析结果显示NIPT检测双胎21-三体综合征的准确率为94.4%，假阳性率为0.0%，显示双胎NIPT检测比血清学筛查有着更高的检出率和更低的假阳性率。

本研究中，IVF组筛查21-三体综合征的阳性预测值高于对照组，与研究报道一致[12]。IVF组因样本量较小，18-三体综合征、13-三体综合征和其他染色体异常暂无高风险数据，缺乏与自然受孕孕妇的可对比性。但对照组18-三体综合征的阳性符合率为57.1%，13-三体综合征筛查准确性最弱，4例均为假阴性，与朱赛娟等[13]报道结果相近。其阳性预测值低与非整倍体的流行率相关，临床上对低风险的孕妇进行NIPT检测时PPV会相对偏低，导致假阳性结果[14]。对照组性染色体异常和其他染色体异常的PPV分别为27.3%和17.4%，故不推荐NIPT用于筛查21、18、13号染色体以外的常染色体非整倍体，且应告知患者NIPT对于性染色体非整倍体筛查的假阳性率较高，并说明原因；但筛查结果提示性染色体非整倍体阳性时，应提供专业遗传咨询和产前诊断[8]。NIPT的假阴性率不高，其提示的阴性结果较可信，因而临床上对于NIPT提示阴性的结果往往是建议继续定期进行超声等常规产检而非进行侵入性产前诊断。

NIPT作为一项筛查技术并不能诊断胎儿染色体异常，只是将孕妇分成高风险和低风险这两类人群。母体染色体拷贝数变异、母体嵌合、限制性胎盘嵌合、母体恶性肿瘤等均可能导致结果假阳性；胎儿嵌合体、胎儿游离DNA水平过低等因素可能导致假阴性。IVF方式的孕育过程较复杂，2个或2个以上胚胎植入带来的后果是可能存在的双胎消失综合征或减胎造成的胚胎停止发育[15]，胚胎停止发育后，其胎盘可能与存活胚胎胎盘融合形成胎盘嵌合。NIPT检测的是胎盘游离DNA，而不是胚胎本身DNA，二者出现不一致时对后续结果准确性有影响。对IVF孕妇应充分知情告知后再行NIPT检测，21-三体综合征以外的阳性结果应谨慎解释，并需要详细的超声检查和遗传专家咨询。

随着近年来胚胎移植前遗传学检测技术的成熟和临床转化，对移植前胚胎染色体进行非整倍体检查，有效提高了患者妊娠成功率并降低新生儿出生缺陷的发生率。高通量测序检验技术在遗传学检测中的应用是未来的趋势，目前因存在研究样本量少、技术局限、检测费用高等情况，故还未在本地广泛开展。