SAT-TB联合T-SPOT.TB或FQ-PCR在痰涂片阴性肺结核诊断中的应用

周晓庆，李斐，杨淑芳

（义马煤业集团股份有限公司总医院检验科，河南 三门峡 472300）

目前临床上针对肺结核，采用痰涂片法、结核分枝杆菌培养法等常规方法诊断。但经实践发现，痰涂片法的阳性率不高，极易出现误诊、漏诊等事件；而结核分枝杆菌培养法具有较高的检出率，但因耗时长，无法实现快速筛查的目标，并且容易延误病情，增加结核病播散风险[1]。基于此，寻求一种特异性高、敏感性高、准确性高，且能够快速诊断的检测方法显得尤为重要，也是临床一直研究的重要课题。随着医学检验技术的不断发展，分子生物学检测技术已成为诊断传染性疾病的重要方法，譬如结核分枝杆菌RNA恒温扩增实时荧光检测（SAT-TB）、结核T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）、荧光定量PCR（FQ-PCR）等[2,3]。有学者研究表示，SAT-TB联合T-SPOT.TB或FQ-PCR检测方法比单独使用更有利于提高阳性检出率，但临床关于以上检测方法联合应用的研究报道较少，尚不清楚联合使用后，其特异性、敏感度及准确率是否能得到显著提高。故本次选取158例痰涂片阴性疑似肺结核患者的临床资料进行回顾性分析，旨在探讨SAT-TB联合T-SPOT.TB或FQ-PCR的诊断价值。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2018年3月-2020年3月诊治的158例痰涂片阴性疑似肺结核患者的临床资料。经临床确诊为肺结核共52例、非肺结核共106例。诊断标准：符合“肺结核诊断和治疗指南(2001年订)”中的诊断标准；纳入标准：⑴经相关检查表明存在与活动性肺结核相符的病变；⑵无其他肺部疾病；⑶无恶性肿瘤等疾病。排除标准：⑴临床资料不全；⑵合并精神类疾病；⑶合并肺癌等疾病。158例受检人员中男性共82例、女性共76例；年龄范围35～72岁，年龄平均值51.45±1.45岁。

1.2 方法 回顾性分析本次所有受检人员行SATTB、T-SPOT.TB、FQ-PCR检测的临床资料。其步骤如下。

1.2.1 标本处理 先为受检人员行气管表面麻醉，置入纤维支气管镜探测支气管肺段情况，采用质量浓度为9g/L的NaCl注射液15mg灌洗胸部，经X线平片显示病灶部位，再采用负压吸引器回收灌洗液10ml，置于无菌瓶中；随后在回收灌洗液加入质量浓度为40g/L的NaCl注射液，待其液化后取1ml置于试管中，离心5min，弃上清液后再次离心，取部分下层沉渣，采用裂解液50μl行重悬，超声破损15min，取2μl制成涂片。

1.2.2 SAT-TB检测方法 采用上海仁度生物科技有限公司提供的TB核酸检测试剂盒，操作方法按照说明书进行。其中，以样本曲线和阈值曲线产生的交叉点为横坐标读数，即DT,当DT小于或等于35min表示为阳性，当DT大于40min则表示为阴性，若DT大于35min，但小于或等于40min，则需重新检测。

1.2.3 T-SPOT.TB检测方法 采用上海复星医药科技有限公司提供的结核感染T细胞斑点诊断试剂盒，当ESAT-6或CFP-10任一检测孔达到以下标准则判断其为阳性：⑴空白对照孔斑点数目小于或等于5个,检测孔斑点数目减少空白对照孔斑点数目后仍大于或等于6个；⑵空白对照孔斑点数目大于或等于6个,检测孔斑点数目是空白对照孔斑点数目的2倍。

1.2.4 FQ-PCR检测方法 采用平台PCR仪性荧光探针法检测从痰标本中提取的DNA及RNA，试剂盒由深圳亚能生物技术有限公司提供。按照说明书进行操作。

1.3 观察指标

1.3.1 观察SAT-TB、T-SPOT.TB、FQ-PCR、SATTB联合T-SPOT.TB、SAT-TB联合FQ-PCR方法检测肺结核的阳性预测值、阴性预测值。

1.3.2 分析上述五种方法准确率、误诊率、漏诊率。

1.3.3 评估上述五种方法诊断肺结核的AUC值、敏感度、特异度。

1.4 统计学分析 采用SPSS22.0软件分析本次数据。计量资料用（）表示，行独立样本t检验；计数资料用（n；%）表示，行χ2检验；诊断价值采用ROC曲线分析；P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三种检测方法的阳、阴预测值比较158例痰涂片阴性疑似肺结核患者经SAT-TB检测后阳性预测值为68.25%，阴性预测值为90.53%；经经TSPOT.TB检查后阳性预测值为68.97%，阴性预测值为88.00%；经FQ-PCR检查后阳性预测值为61.02%，阴性预测值为83.84%；均低于金标准（P＜0.05）。见表1。

表1 SAT-TB与金标准的阳、阴性率比较

2.2 联合检测的阳、阴性预测值比较158例痰涂片阴性疑似肺结核患者经SAT-TB联合T-SPOT.TB检测后阳性预测值为96.15%，阴性预测值为98.11%；经SAT-TB联合FQ-PCR检查后阳性预测值为85.45%，阴性预测值为95.14%；两种方法比较，差异存在统计学意义（P＜0.05）。

表2 SAT-TB联合T-SPOT.TB与金标准的阳、阴性率比较

2.3 准确率、误诊率、漏诊率比较SAT-TB联合T-SPOT.TB、SAT-TB联合FQ-PCR的准确率高于SAT-TB、T-SPOT.TB、FQ-PCR单独检测，而误诊率、漏诊率低于SAT-TB、T-SPOT.TB、FQ-PCR单独检测（P＜0.05）；SAT-TB联合T-SPOT.TB的准确率高于SAT-TB联合FQ-PCR（P＜0.05）;但误诊率、漏诊率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 五种检查方法的敏感性、特异性、准确率、误诊率、漏诊率比较

2.4 ROC曲 线 分 析SAT-TB、SAT-TB、T-SPOT.TB、FQ-PCR、SAT-TB联 合T-SPOT.TB、SAT-TB联合FQ-PCR诊断肺结核的AUC值分别为（0.819、0.800、0.738、0.971、0.914，P＜0.05）；敏感度分别为82.70%、76.90%、69.20%、96.20%、90.40%；特异度分别为81.10%、83.00%、78.30%、98.10%、92.50%。见表4。

表4 五种方法的曲线下面积AUC值

3 讨论

图1 五种方法的ROC曲线分析

经流行病学调查[4]发现，我国是肺结核病的高发国家，目前在世界位居第三。但因肺结核患者的临床症状复杂多样及影像学改变有时无特异性，导致其发现率在临床上一直不高，尤其是痰涂片对肺结核的诊断，一直是困扰临床医师的难题[5,6]。痰培养是临床诊断肺结核的金标准，虽然改良后的Bactec快速结核菌培养系统比传统的培养时间更短，但离临床对肺结核病的快速诊断要求仍有一定距离。FQ-PCR是在常规PCR扩增的基础上，采用荧光标记探针进行定量检测，且通过结合杂交与广谱技术进行定量分析，其目的在于提高检出率。但进一步分析发现，因其检测的靶标为DNA，故无法区分病变活性及感染进程，且在交叉感染时，会对检测结果造成一定影响[7]。而T-SPOT.TB检测方法因需时短、特异性高等特点，得到广泛开展，但也存在不足之处，同样无法区分活动性结核病与结核分枝杆菌潜伏感染，另外，也不能预测结核分枝杆菌潜伏感染是否存在发展为活动性结核病的风险，故此在临床上受到一定限制[8-10]。

SAT-TB为核酸检测技术，通过检测结核分枝杆菌特异的16s rRNA,再根据扩增靶标判断标本是否存在结核分枝杆菌,与上述两种不同,因以RNA为检测靶标,所以在检测过程中能准确区分病菌的活性，并且不易被污染。但经实践发现，也存在不足之处，既检测过程中易造成假阴性结果。本文基于假阴性结果的考虑,建议与T-SPOT.TB或FQ-PCR联合检测,以此提高准确诊断率[11,12]。研究结果显示，SAT-TB联合T-SPOT.TB、SAT-TB联合FQ-PCR的准确率高于SAT-TB、T-SPOT.TB、FQ-PCR单独检测，但两种联合方法相比，SAT-TB联合T-SPOT.TB的准确率更高，且ROC曲线分析中可见，SAT-TB联合T-SPOT.TB的AUC值高达0.971，提示其具有较高的预测价值。可能与提高病菌活性与分枝杆菌种类鉴别力度有关,从而为临床判断疑似肺结核提供客观依据。其中，SAT-TB、FQ-PCR检测方法与痰涂片不同，是通过收集受检人员的肺泡灌洗液，再制成涂片，实施快速诊断，对于无痰受检人员而言,肺泡灌洗液的收集能使检测技术更具有时效性、简便性及准确性。另外,与临床常用的涂片荧光染色相比,其检测时间更短,可从1d以上缩短至1.5h，有利于实现快速有效诊断的目标[13-16]。此外,SAT-TB联合T-SPOT.TB、SATTB联合FQ-PCR的误诊率、漏诊率低于SAT-TB、T-SPOT.TB、FQ-PCR单独检测,提示联合检测有利于提高诊断确诊率,但在两种联合检测方法比较中，发现SAT-TB联合T-SPOT.TB检测的误诊率、漏诊率更低。其中，SAT-TB联合T-SPOT.TB检测出现2例假阳性与2例假阴性，经分析发现，其原因与肺泡液收集时支气管镜消毒不严格或标本运输过程中受到污染等因素具有一定相关性。基于此，在操作过程中应加强关注，且通过采取有效的应对措施，避免对诊断结果造成不良影响。

综上所述，SAT-TB联合T-SPOT.TB或FQPCR在痰涂片阴性肺结核中具有较高的诊断价值，能够减少漏诊及误诊。