血清miR-221、Aβ1-42水平与帕金森病患者认知功能障碍的相关性

谷丽丽，高永英，陈宁宁

（河南省直第三人民医院神经内科，河南 郑州 450000）

认知功能障碍是帕金森病（Parkinson’s disease，PD）患者常见非运动症，报道指出，约25%-60%的PD患者可能会并发认知功能障碍，且30%左右的患者在就诊时已合并认知功能障碍[1]。轻微认知功能障碍虽不会对PD患者日常生活造成严重影响，但随着认知功能障碍程度的加重，可能会进展为痴呆，降低患者生活质量[2]。因此，明确可能与PD患者认知功能障碍的相关指标，对指导早期干预、遏制疾病进展尤为重要。蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment，MoCA）是临床评估认知功能障碍常用方法，该方式虽可明确患者认知功能，但其所获结果容易无法定量评估PD患者认知功能障碍风险，临床应用受限[3]。微小RNA（microRNA，miR）是一种内源性小分子单链RNA，具有调控细胞增殖、凋亡等作用，且miR-221与心血管疾病、神经退行性疾病的发生、发展密切相关[4]。β淀粉样蛋白1-42（Amyloid β-protein 1-42，Aβ1-42）是淀粉样前体蛋白降解产物，其具有神经毒性，可促进多巴胺能神经元变性，推进PD疾病进展[5]。结合miR-221、Aβ1-42作用机制猜测,二者可能与PD患者认知功能障碍有关，但具体关系尚未明确。鉴于此，本研究重在分析血清miR-221、Aβ1-42水平与PD患者认知功能障碍的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 研究的实施获得医院医学伦理委员会批准。前瞻纳入医院2018年5月-2020年6月就诊的113例PD患者为研究对象，患者及家属均知情此项研究，且签署研究知情同意书。113例患者中男53例，女60例；年龄57～71岁，平均（63.59±2.16）岁；病程1～7年，平均（4.33±0.65）年；受教育程度：初中及以下48例，高中或中专41例，专科及以上24例。

1.2 入选标准 ⑴纳入标准：PD符合《中国帕金森病的诊断标准(2016版)》[6]中相关诊断标准，且经临床体征、影响学检查等确诊；首次就诊；视觉、听觉正常，具备基础阅读能力，可配合研究。⑵排除标准：合并先天性心脏病、肾衰竭等重要脏器病变；既往有痴呆、精神病或其他中枢系统疾病；合并感染性疾病；既往有脑卒中病史或颅脑损伤史；合并脑血管疾病；合并恶性肿瘤；合并炎症疾病；近1个月接受相关治疗。

1.3 方法

1.3.1 认知功能障碍评估及分组 于患者入院时，采用MoCA[7]评估患者认知功能障碍情况，量表包括注意与集中、执行能力、语言、视空间技能、抽象思维、记忆、计算和定向力等领域，共有11个项目，量表得分范围于0-30分，得分越高表示认知功能较好；将MoCA得分＜26分患者纳入认知功能障碍组，反之则纳入认知功能正常组。

1.3.2 血清miR-221、Aβ1-42水平检测 于患者入院时，采集其空腹肘部静脉血5ml，采用低速离心机（上海安亭科学仪器有限公司，型号：TDL-5-A）以4000r/min转速离心10min，离心半径为10cm，采集血清分别置于2支无菌干燥试管内，其中一支用于血清miR-221检测，检测方法：将血清样本置于4℃环境下，用高速离心机（长沙湘悦离心机有限公司，型号：TG16-X）以12000r/min转速离心5min，离心半径为8cm，去除红细胞后，用mirVana RNA Isolation Kit提取样本RNA，然后采用逆转录试剂盒逆转提取样本cDNA；逆转结束进行聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）扩增反应，用TaqMan miRNA Assays建立20μl反应体系[逆转录引物2μl、10μmol/L miRNA-21上游与下游引物各0.6μl、缓冲液4μl、DEPC水12.15μl、50×ROX 0.25μl、10μmol/L TaqM按MGB探针0.4μl]，然后荧光定量PCR仪（济南泰医生物技术有限公司，型号：Lepgen-96）进行扩增反应，扩增条件：95℃环境下反应30s，设定1个循环；后分别在95℃环境下反应5s、60℃环境下反应34s，设定40个循环；反应结束用2-△△CT法分析miR-221表达，检验所有相关试剂均购自美国Ambion公司。另一支用于血清Aβ1-42检测，检测方法：采用酶联免疫吸附试验法测定Aβ1-42水平，检测试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，检验流程严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 基线资料采集 设计基线资料填写表，询问并记录患者相关基线资料，内容包括：性别（男、女）、年龄、病程、受教育程度（初中及以下、高中或中专、专科及以上）、合并基础疾病[高血压：收缩压水平≥140mmHg，舒张压水平≥90mmHg；糖尿病：空腹血糖水平≥7.0mmol/L，和（或）餐后2h血糖水平≥11.1mmol/L]、病情分期[根据Hoehn-Yahr分期[8]（H&Y）评估,早期（H&Y分期＜Ⅱ期）、中期（H&Y分期于Ⅱ-Ⅲ期）、晚期（H&Y分期＞Ⅲ期）]等。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0软件进行数据处理，计数资料以百分数和例数表示，用χ2检验；等级资料采用秩和检验；全部计量资料均经Shapiro-Wilk正态性检验，符合正态分布的计量资料采用“”表示，两组间比较采用独立样本t检验；偏态分布的计量资料采用中位数（四分位数间距）[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验；经Logistic回归分析，检验血清miR-221、Aβ1-42水平与PD患者认知功能障碍的关系；绘制受试者工作曲线（Receiver operator characteristic，ROC），并计算曲线下面积（Area Under Curve，AUC），检验血清miR-221、Aβ1-42水平预测PD患者认知功能障碍风险价值，AUC值＞0.9表示预测性能较高，0.71-0.90表示有一定预测性能，0.5-0.7表示预测性能较差；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD患者认知功能障碍情况113例PD患者中,有34例伴有认知功能障碍,占30.09%（34/113）,平均MoCA得分为23.00（20.00，25.00）分；79例认知功能正常，占69.91%（79/113），平均MoCA得分为27.00（26.00，30.00）分。

2.2 认知功能障碍、正常PD患者相关基线资料比较 认知功能障组血清miR-221水平高于认知功能正常组，Aβ1-42水平低于认知功能正常组，差异有统计学意义（P＜0.05）；组间其他基线资料比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 认知功能障碍、正常PD患者相关基线资料比较

2.3 血清miR-221、Aβ1-42水平与PD患者认知功能障碍的关系回归分析 将2.2中比较差异有意义的变量miR-221、Aβ1-42纳入作为自变量（均为连续变量），将PD患者认知功能情况作为因变量（1=认知功能障碍，0=认知功能正常），经Logistic回归分析结果显示，血清miR-221、Aβ1-42异常表达与PD患者认知功能障碍有关，miR-221升高可能是PD患者认知功能障碍的影响因子（OR＞1，P＜0.05）；Aβ1-42升高可能是PD患者认知功能障碍的保护因子（OR＜1，P＜0.05）。见表2。

表2 血清miR-221、Aβ1-42水平与PD患者认知功能障碍的关系回归分析结果

2.4 血清miR-221、Aβ1-42水平预测PD患者认知功能障碍风险价值分析 绘制ROC曲线发现（见图1），血清miR-221、Aβ1-42单一及联合预测PD患者认知功能障碍风险的AUC分别为0.864、0.813、0.933，AUC均＞0.80，均有一定预测价值，且当二者cut-off值分别取28.305、1.135μg/L时，预测价值最佳。相关参数见表3。

图1 血清miR-221、Aβ1-42水平预测PD患者认知功能障碍风险价值的ROC曲线图

表3 血清miR-221、Aβ1-42水平预测PD患者认知功能障碍风险价值分析结果

3 讨论

研究指出，miR与神经系统退行性病变的发生密切相关，miR可结合靶向mRNA非翻译区，导致miR逆转录沉默，从而抑制mRNA翻译，而mRNA表达缺失，会造成特异性蛋白含量升高，继而引发相应神经系统退行性病变[9]。α-突触核蛋白（αsynuclein，α-Syn）聚集所致的多巴胺神经元凋亡、神经元损伤是PD发生的主要原因之一，而miR-221可调控α-Syn表达[10]。既往miR-221多用于恶性肿瘤诊断，但近年来研究发现，miR-221可调控转运铁蛋白受体2表达，诱导铁元素聚集，引发脂质过氧化反应、线粒体功能障碍等，从而促进PD发生与发展[11]。同时，免疫炎症反应已被证实是PD进展的关键因素之一，而miR-221可激活炎症信号通路，加重机体炎症反应[12]。Aβ1-42蛋白主要表达于大脑中，通常情况下，脑内Aβ1-42生成、降解相对平衡，经β-分泌酶途径可转化为胰岛素降解酶于脑啡肽酶，且血-脑脊液屏障Aβ可利用高级糖基化产物受体向脑内运转和低密度脂蛋白相关蛋白1向外转运Aβ1-42，从而维持血-脑Aβ1-42平衡[13]。但血-脑Aβ1-42表达失衡，会导致Aβ1-42异常聚积，而Aβ1-42具有神经毒性，可能会导致多巴胺神经元退行性病变[14]。此外，相关研究表明，Aβ1-42会诱导一氧化氮生成，引发炎症级联与氧化应激反应，从而损伤脑蛋白质与膜性结构，从而导致神经元凋亡，推进PD发展[15]。

为验证血清miR-221、Aβ1-42可能与PD患者认知功能障碍有关假设，本研究初步比较认知功能障碍、认知功能正常PD患者相关基线资料，后经Logistic回归分析结果显示，血清miR-221、Aβ1-42异常表达与PD患者认知功能障碍有关，miR-221升高可能是PD患者认知功能障碍的影响因子，Aβ1-42升高可能是PD患者认知功能障碍的保护因子，证实猜测。分析原因在于，miR-221水平升高会促进α-Syn生成，加重神经元损伤，从而加重病情严重程度，增加PD患者认知功能障碍风险[16]。血清Aβ1-42水平降低，会导致脑内Aβ1-42大量聚积，损伤多巴胺神经元，且可能会引发氧化应激反应，加重脑蛋白质损伤，从而加重病情，引发PD患者认知功能障碍[17]。进一步绘制ROC曲线发现，血清miR-221、Aβ1-42预测PD患者认知功能障碍风险有理想的价值，在二者cut-off值分别取28.305、1.135μg/L时，可获得最佳预测价值，且随着miR-221表达升高，Aβ1-42水平降低，患者认知功能障碍风险增加。针对此结果建议，于PD患者入院时临床应检测miR-221、Aβ1-42水平，辅助评估患者认知功能障碍风险，且对于认知功能障碍的患者，应尽早予以脑循环改善剂、能量代谢激活剂、神经生长因子保护剂等对症治疗，以遏制疾病进展。此外，本研究发现，血清miR-221、Aβ1-42联合检测预测PD患者认知功能障碍风险价值高于各项单一检测，考虑未来可将二者结合观察，以提高患者整体获益。但本研究并未对患者进行长期随访，无法明确血清miR-221、Aβ1-42与PD患者认知功能障碍进展的关系，研究存有局限，未来仍需展开前瞻性研究加以验证。

综上所述，PD患者认知功能障碍可能与患者血清miR-221升高、Aβ1-42降低有关，考虑未来可检测患者入院时血清miR-221、Aβ1-42水平，辅助评估PD患者认知功能障碍风险。