TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA在宫颈病变中的诊断价值及与临床病理因素的相关性

赵慧敏，李炳琪

（1.郑州卷烟厂康复医院妇科，河南 郑州 450000；2.郑州大学第一附属医院妇产科，河南 郑州 450000）

宫颈癌为15岁及以上女性病死首要原因之一，具有发病率高、病死率高等特征[1]。流行病学监测数据显示，发展中国家宫颈癌每年新发病例占全球患病人数的90%左右，严重威胁女性健康[2]。国内外众多科学实验及统计资料均指向人乳头状瘤病毒（HPV）长期作用是诱发宫颈癌的主要危险因素，同时HPV DNA、脱落细胞联合诊断是临床早期发现宫颈癌的重要手段[3,4]。但宫颈癌病变是一个长期过程，尤其是HPV在女性中有较高携带率、感染率，但大部分可自行清除，HPV DNA检测缺乏特异性。近年随研究深入发现，炎性微环境在多种肿瘤进展、血管新生、侵袭中发挥重要作用，而上述生物学过程主要由包括肿瘤坏死因子（TNF）在内的诸多炎症细胞因子、生长因子实现调控过程[5,6]。肿瘤坏死因子受体-1(TNFR1)mRNA异常表达可反映TNF活性状态，二者结合效应可影响肿瘤增殖、转移、血管形成等多个环节。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1（Tiam1）是一种原癌基因，其已被临床证实在不同类型细胞形态转化、运动、等过程中发挥重要作用[7]。基于上述研究，本研究尝试分析TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表达量与宫颈病变临床病理因素的相关性，旨在为临床防治宫颈癌、完善预警机制提供更多选择。报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取我院2014年1月-2016年6月收治的宫颈病变患者162例作为研究对象。年龄26～63岁，平均44.41±6.33岁。取162例患者宫颈病变组织进行病理学检测，判断细胞分级、组织类型、淋巴结转移、肌层浸润情况。宫颈癌患者42例，宫颈上皮内瘤病变（CIN）患者58例，子宫肌瘤患者62例。纳入标准：原发性宫颈病变；均行手术治疗，经病理学诊断确诊宫颈病变情况，且为首次确诊；入组前未经生物制剂、放化疗、中药制剂治疗。排除标准：继发性宫颈病变者；患者既往因阴道或宫颈病变接受激光、药物或冷冻治疗者；血人绒毛膜促性腺激素(HCG)检测确认当前妊娠状态者；临床资料缺失者。

1.2 方法 ⑴主要设备、试剂：美国Invitrogen总RNA提取试剂盒，日本Takara逆转录、PCR试剂盒，Tiam1、TNFR1与内参引物均由安迪生物科技上海有限公司设计完成，SP免疫组织化学试剂盒、PBS、DAB试剂均为上海西塘生物科技有效公司提供，兔抗人Tiam1、TNFR1多克隆抗体购自北京奥维亚生物技术有限公司，实时荧光定量PCR系统购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，光学显微镜购自日本基恩士。⑵检测方法：取不同子宫颈组织，研磨，加细胞裂解液，以总RNA提取试剂盒提取总RNA,紫外分光光度计测所提取总RNA纯度,A260/A280≥1.8为合格。逆转录总RNA为单链模板cDNA，采取PCR试剂盒实施扩增。引物序列：Tiam1引物，上游5′-CAGGACTCCACGGGGCCTCA-3′；下游5′-AGTGCTCCTCGCTCTCCGCA-3′；β-actin引物，上游5′-CGGGGTCACCCACACTGTGC-3′；下游5′-GGGCAGCGGAACCGCTCATT-3′。PCR反 应 条 件94℃30s，92℃30s，56℃30s，72℃30s，连续36个循环，设置平行反应复孔3个/样品。TNFR1引物，正向引物5′-CTAGACACTGATGACcCCGC-3′；反向引物5′-GAATTCCTTCCAG CGCAACG-3′。PCR反 应 条 件50℃2min，95℃10min，95℃15s，30℃30s，共40个循环。均采取2-△△Ct法 获 取 组 织 内Tiam1、TNFR1基 因 相 对 表 达量。

1.3 观察指标 ⑴不同患者TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表达量。⑵不同临床病理特征宫颈癌患者TNFR1 mRNA表达量。⑶不同临床病理特征宫颈癌患者Tiam1 mRNA表达量。⑷TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表达量与病理特征相关性。⑸生存分析。

1.4 统计学处理采用SPSS22.0统计分析软件，相关性采取Pearson相关性系数分析；符合正态分布的计量资料以表示，多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；Kaplan-Meier曲线进行生存分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同患者TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表达量TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表达量随宫颈病变严重程度增加呈升高趋势（P＜0.05），见表1。

表1 不同患者TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表达量比较()

表1 不同患者TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表达量比较()

疾病类型 例数宫颈癌患者CIN患者子宫肌瘤患者F值P值42 58 62 TNFR1 mRNA 2.25±0.38 0.91±0.20 0.40±0.13 756.027＜0.001 Tiam1 mRNA 2.08±0.16 1.71±0.14 1.29±0.11 438.046＜0.001

2.2 不同临床病理特征宫颈癌患者TNFR1 mRNA表达量 不同年龄、病理类型宫颈癌患者TNFR1 mRNAmRNA表达量无明显差异（P＞0.05）；不同TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移情况、浸润深度、分化程度患者TNFR1 mRNA表达量相比，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 不同临床病理特征宫颈癌患者TNFR1 mRNA表达量比较()

表2 不同临床病理特征宫颈癌患者TNFR1 mRNA表达量比较()

临床病理特征 例数年龄（岁）≤45＞45肿瘤大小（cm）≤4＞4病理类型鳞癌腺癌TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期淋巴结转移TNFR1 mRNA t/F值P值0.528 0.600 25 17 2.23±0.28 2.28±0.33 10.288＜0.001 22 20 1.80±0.23 2.75±0.36 0.669 0.507 27 15 2.23±0.26 2.29±0.31 8.007＜0.001 24 18 1.96±0.25 2.64±0.30 7.354＜0.001否是30 12 2.04±0.28 2.78±0.33浸润深度＜1/2≥1/2分化程度高分化中分化低分化11.171＜0.001 22 20 1.81±0.22 2.73±0.31 12.233＜0.001 12 20 10 2.01±0.20 2.24±0.24 2.56±0.35

2.3 不同临床病理特征宫颈癌患者Tiam1 mRNA表达量 不同年龄、病理类型宫颈癌患者Tiam1 mRNA表达量无明显差异（P＞0.05）；不同TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移情况、浸润深度、分化程度患者Tiam1 mRNA表达量相比，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 不同临床病理特征宫颈癌患者Tiam1 mRNA表达量比较()

表3 不同临床病理特征宫颈癌患者Tiam1 mRNA表达量比较()

临床病理特征 例数年龄（岁）≤45＞45肿瘤大小（cm）≤4＞4病理类型鳞癌腺癌TNM分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期淋巴结转移Tiam1 mRNA t/F值P值0.876 0.387 25 17 2.05±0.16 2.10±0.21 2.520 0.016 22 20 2.02±0.13 2.15±0.20 0.526 0.602 27 15 2.07±0.17 2.10±0.19 6.766＜0.001 24 18 1.92±0.12 2.29±0.23 6.444＜0.001否是30 12 1.97±0.14 2.36±0.25浸润深度＜1/2≥1/2分化程度高分化中分化低分化6.214＜0.001 22 20 1.90±0.15 2.28±0.24 14.480＜0.001 12 20 10 1.92±0.13 2.07±0.15 2.29±0.21

2.4 TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表达量与病理特征相关性Pearson相关性分析，TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表达量与TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、浸润深度呈正相关，与分化程度呈负相关（P＜0.05），见表4。

表4 TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA表达量与病理特征相关性

2.5 生存分析 随访36个月，根据ROC曲线最佳截断值分高表达患者、低表达患者，KM曲线分析显示，高表达患者、低表达患者TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA生存曲线对比，差异有统计学意义（χ21=5.075，P1=0.024；χ22=5.125，P2=0.024），见图1-2。

图1 生存曲线（TNFR1 mRNA）

3 讨论

近年随癌症患病人数逐年升高,其已发展成困扰人类健康、导致死亡的主要病因，在全世界无论发达国家或发展、落后国家，癌症已成为一个巨大的社会经济负担[8,9]。宫颈癌细胞迁移、侵袭能力较强，临床数据显示，手术时存在盆腔淋巴结转移者术后复发率高达80%[10]。因此，从分子层面探究影响宫颈癌细胞迁移、侵袭相关机制，对早期诊断、提供基因治疗靶位具有重要意义。

图2 生存曲线（Tiam1 mRNA）

Tiam1是一种重要促恶性细胞转移基因，参与介导二磷酸鸟嘌呤核苷酸及三磷酸鸟嘌呤核苷酸转换、Ras超家族催化等生物学过程，基础研究显示，Tiam1与骨架结构重构、细胞形态转化、迁移、侵袭、运动等过程关系密切[11]。本研究结果显示，随宫颈病变严重程度增加Tiam1 mRNA表达量呈升高趋势（P＜0.05），与学者汪俊等[12]研究结果近似。学者张源等[13]研究指出，Tiam1蛋白表达与胃腺癌临床分期、分化程度、浆膜浸润、淋巴结转移等病理因素关系密切。本研究也显示，不同TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移情况、浸润深度、分化程度宫颈癌患者Tiam1 mRNA表达量存在显著差异（P＜0.05），进一步推测，Tiam1在肿瘤侵袭、转移中发挥重要作用，可能参与肿瘤进展过程。分析Tiam1 mRNA异常转录致Tiam1过表达可激活RAC1癌基因，参与并调控恶性细胞黏附、运动、细胞凋亡等过程，促进正常细胞恶性转化。本研究也发现Tiam1 mRNA表达量与TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、浸润深度呈正相关。此外，国外有学者指出，Tiam1与恶性病变患者预后关系密切，其过表达是浆液性卵巢癌患者预后不良的独立危险因素[14]。本研究KM生存分析显示，随访36个月高表达患者生存率51.80%显著低于低表达患者91.50%，说明Tiam1 mRNA表达与宫颈癌患者预后关系密切。

TNF因其炎症介质特性，在慢性炎症疾病中已被证实参与恶性肿瘤发生、发展、转移过程。学者Wang H等[15]等所提供研究证据显示，TNF缺陷小鼠能抑制12-0-十四酰佛波醇-13-乙酸酯（TPA）所介导的皮肤癌变。病理实验证实，无论在癌变早期阶段，或是进展、转移阶段，TNF均可与其受体TNFR1结合参与新生血管生成、基质破坏等生物学过程，发挥促肿瘤效应[16]。本研究对不同病理阶段宫颈组织TNFR1 mRNA实验数据分析，宫颈病变患者随病情加重TNFR1 mRNA表达呈升高趋势，且其表达与TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、浸润深度呈正相关，与分化程度呈负相关（P＜0.05）。学者Zhang T等[17]也研究发现，宫颈癌患者外周血存在TNFR1高表达，说明发生宫颈癌时，机体免疫监视系统激活，刺激单核巨噬细胞大量分泌TNF，恶性细胞表面TNFR1相应增加，共同参与调控宫颈癌免疫网络。本研究高表达患者、低表达患者TNFR1 mRNA生存曲线间存在显著差异（P＜0.05），宫颈组织中TNFR1 mRNA高表达预示预后不良，可作为预后评估指标。

综上可知，宫颈病变组织中存在TNFR1 mRNA、Tiam1 mRNA异常表达情况，且与分期、肿瘤大小等临床病理因素关系密切，联合检测可为临床诊断、预后评估提供理论依据。