血清miRNA-155联合IL-6水平检测对肝细胞肝癌患者预后的评估价值

陈院朝，齐惠丽，芦晗，王升

（濮阳市安阳地区医院检验科，河南 安阳 455000）

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是一种具有恶性程度高、进展迅速和预后差等特点的全球性疾病，其发病率和死亡率分别居恶性肿瘤的前五位[1]。根治性切除手术是目前肝癌患者主要的治疗手段，可达到缓解临床症状、延长生存期和改善生活质量的目的[2]，但HCC术后的复发率较高，术后5年内复发率可高达60%以上，患者往往预后较差。因此，早期采取有效方法评估HCC患者术后预后情况对于及早制定干预方案并提高患者生存率具有重要的临床意义。微小核糖核酸-155（microRNA-155,miRNA-155）是一种生物活性RNA分子，可在不同疾病人群的血清中呈特异性和稳定表达[3]，已被发现与食管鳞状细胞癌、胰腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生、发展和转移具有紧密联系，但其在HCC患者中的临床应用价值尚不明确；白介素-6（Interleukin-6,IL-6）是公认的一种炎症因子，其高水平可反映HCC患者机体的炎症微环境状态，与HCC的病情进展和生存期有关[4]。目前，对于miRNA-155与肝癌患者的主要集中于检测癌组织中的miRNA-155表达，且对于联合检测血清miRNA-155和IL-6水平评估HCC患者预后的应用价值尚不清楚，基于此，本研究旨在探讨血清miRNA-155和IL-6在HCC患者血清中的表达水平，及二者联合检测对预后的评估价值，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾性选取2016年10月-2017年12月期间于我院收治的88例HCC患者作为研究对象，对其临床资料和血清标本进行回顾性分析。88例患者中男性56例，女性32例，年龄36～83岁，平均年龄59.15±18.29岁；病理证实Edmondson分级：I级19例；II级25例；III级24例；IV级20例。纳入标准：⑴结合影像学检查、实验室检测等，所有患者均符合2011年《原发性肝癌诊疗规范》HCC相关诊断标准[5]；⑵均行根治性切除术治疗，并保存有血清标本者；⑶术前未接受放、化疗或射频消融术等抗肿瘤治疗者；⑷均完成2年随访，且具备完整的临床及随访资料者。排除标准：⑴严重凝血功能障碍、肾功能异常及严重感染者；⑵合并其他恶性肿瘤、严重心脑血管疾病者；⑶全身免疫性疾病者；⑷精神异常、认知障碍患者。本研究在获得医院伦理委员会审核批准后实施，研究内容设计符合《世界赫尔辛基宣言》。所有患者血清标本均取自患者的外周血，并经2000r/min离心后取上清液置于液氮中保存。

1.2 方法

1.2.1 随访方案 随访从患者根治性切除手术后首日开始，采用门诊随访以及电话随访的方式对入组患者进行追踪，门诊复查内容为CT或MRI，以及血清甲胎蛋白检查，并详细记录患者随访期间肿瘤的复发、转移情况，随访至患者死亡日期或术后2年为止。

1.2.2 分组方法 以患者随访两年内出现的复发及转移情况表示为预后不良，肿瘤复发指经影像学检查发现患者肝内重复出现肝癌特点的结节或出现非原发性肝癌影响因素之外引起的AFP异常升高（>400ng/ml）[6]；转移指临床及影像学检查显示有淋巴结或远处器官转移，复发及转移病灶均经病理检查进行诊断确诊[7]。将所有入组患者按照随访期间有无复发转移分为两组：有局部复发或远处转移的预后不良组和无局部复发及远处转移的预后良好组。

1.2.3 血清miRNA-155、IL-6检测 取两组患者冻存的血清标本，经解冻后采用日立7100型全自动生化分析仪检测IL-6水平，测定方法为酶联免疫吸附法，试剂盒购自美国BD公司，操作步骤严格按照试剂盒说明书上执行；并采用实时定量-PCR方法进行血清miRNA-155的检测，采用RNeasy Mini Kit总RNA提取试剂盒（购自美国Life Technology公司）按规定步骤提取血清中游离总RNA，即刻逆转录成cDNA用于扩增。选RUN6为内参照，其中miRNA-155引物序列：5'-CT-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGA-CCCCTAT-3'。依据设计的循环参数进行PCR扩增，扩增设置反应条件：预变性95℃、5 min；95℃、10 s变性，60℃、20 s退火，72℃、20 s延伸，经过35个循环扩增后，根据Ct值分析出miRNA相对表达量，绘制熔解曲线，根据熔解曲线判断PCR产物的特异度。使用2-ΔΔCT法计算HCC患者血清miRNA-155的相对表达量，ΔCT=CT目标-CT内参。

1.3 统计学处理 采用SPSS20.0软件对实验数据进行分析，本研究中涉及的计数资料用%表示，采用χ2检验；计量资料采用“Mean±SD”表示，两组间比较采用两样本t检验，多因素分析采用Logistic回归模型；通过ROC曲线分析miRNA-155对HCC患者预后的预测价值；对各变量间的关系采用Pearson相关性分析，r值确定正、负相关性，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者预后情况 在88例HCC患者中有46例患者出现复发转移，复发转移率为52.27%，为预后不良组；42例（47.73%）未出现复发转移，为预后良好组。预后不良组中出现肿瘤复发38例，淋巴结转移4例，肝内转移2例，肺转移2例。

2.2 不同预后患者的血清miRNA-155、IL-6表达水平及两指标相关性 经检测后，预后不良组患者血清中miRNA-155相对表达量和IL-6水平均明显高于预后良好组（P＜0.05），见表1。相关性分析结果显示，miRNA-155与IL-6的表达呈明显正相关性（r=0.531，P=0.024）。

表1 不同预后患者血清miRNA-155、IL-6表达水平比较

2.3 影响HCC患者预后不良的单因素分析 单因素分析结果显示，两组在年龄、性别、肿瘤数量、乙肝表面抗原及术后介入治疗次数方面比较无明显差异（P＞0.05），两组在肿瘤大小、病理分级、血管侵犯、血清miRNA-155表达和血清IL-6水平方面存在明显差异（P＜0.05），见表2。

表2 影响HCC患者预后不良的单因素分析

2.2 影响HCC患者预后不良的多因素Logisitic回归分析 以HCC患者术后是否出现预后不良作为因变量，将单因素中差异存在统计学意义的因素（肿瘤大小、病理分级、血管侵犯、血清miRNA-155表达和血清IL-6水平）作为自变量，并进行赋值，肿瘤大小（<5.0cm=0，≥5.0cm=1）、病理分级（I级～II级=0，III级～IV级=1）、血管侵犯（无=0，有=1）、血清miRNA-155表达（<1.0=0，≥1.0=1）、血清IL-6水平（<2.2=0，≥2.2=1），并将其纳入Logisitic回归模型中，结果显示有血管侵犯、血清miRNA-155表达≥1.0和血清IL-6水平≥2.2 μg/L是HCC患者出现预后不良的独立预测因素，见表3。

表3 影响HCC患者预后不良的多因素Logisitic回归分析

2.3 单项指标预测与联合预测HCC患者预后不良的ROC曲线分析ROC曲线分析结果显示，血清miRNA-155、IL-6表达量联合预测HCC患者预后不良的ROC曲线下面积0.865明显高于两项指标单独预测的ROC曲线下面积0.787和0.770（P＜0.05）；且血清miRNA-155、IL-6表达量预测HCC患者预后不良时的阈值分别为1.048、2.322μg/L，见图1，表4。

表4 血清miRNA-155、IL-6表达量预测患者预后的ROC曲线下面积

图1 血清miRNA-155、IL-6表达量单独预测与联合预测HCC预后的ROC曲线

3 讨论

微小核糖核酸是机体代谢分子群中新近发现的生物活性RNA分子，能在血清和血浆中持续且稳定的表达，可通过调控细胞的增殖、分化和凋亡发挥抑癌或促癌作用，与多种恶性肿瘤及疾病的发生、发展及预后密切相关[8]。其中miRNA-155是与机体免疫平衡、炎症反应有关的一种促癌基因，已被报道可作为多种癌症和疾病预后的分子标志物[9]。何荣琦等[10]非小细胞肺癌患者癌组织中呈高表达，与癌症的恶性进展和不良预后密切相关，可作为潜在预后评估的标记物；张超等[11]研究发现，miRNA-155在乳腺癌患者血清表达水平比正常人群的要高，且miRNA-155高表达患者术后生存率较低，预后较差。然而目前关于miRNA-155联合IL-6检测在HCC患者预后评估中的应用价值尚不明确，本研究对HCC患者血清miRNA-155、IL-6进行检测，探讨二者对HCC预后的预测价值对于临床上指导HCC患者术后及早干预具有重要作用。

本研究通过血清检测发现，预后不良组患者血清中miRNA-155相对表达量和IL-6水平均明显高于预后良好组，可见miRNA-155、IL-6在HCC预后不良患者血清中呈较高表达。经随访2年，HCC患者出现预后不良的单因素分析结果显示，两组在肿瘤大小、病理分级、血管侵犯、血清miRNA-155表达和血清IL-6水平方面存在明显差异，提示HCC患者术后出现复发或转移可能与以上因素具有一定的联系。进一步的多因素分析结果显示，有血管侵犯、血清miRNA-155表达≥1.0和血清IL-6水平≥2.2 μg/L是HCC患者出现预后不良的独立预测因素。血管侵犯已被研究证实是HCC术后预后不良的主要危险因素之一，可通过肝内转移进一步导致肿瘤复发,降低患者术后生存率[12,13]。同时可以看出，miRNA-155、IL-6在患者血清中的高表达与HCC术后出现不良预后具有重要联系。HCC的发生与机体的长期炎症反应和微环境密切相关,肿瘤的发展过程中炎症反应发挥了决定性作用。miRNA-155是一种已被认为具有癌基因特性的miRNA分子，在多种恶性肿瘤疾病中呈异常高表达[14]。miRNA-155过表达对HCC患者预后的影响机制可能在于：⑴miRNA-155参与T细胞、B细胞和巨噬细胞的发育、分化、活化、增殖及其稳态的维持[15],可通过上调肿瘤坏死因子-α水平，进一步对辅助性T细胞的增殖以及T细胞亚群比例进行调节，导致患者体内免疫应答失衡，加剧炎症反应，有利于癌细胞的增殖和扩散，最终引起肿瘤复发或转移。⑵miRNA-155可能通过对抑癌基因caspase-3活性的抑制，进一步抑制HCC肿瘤细胞凋亡；并且miRNA-155的高表达能够降低TP53INPI的表达，抑制细胞周期捕获，减少癌细胞凋亡[16]。IL-6是一种由Kupffer细胞释放的炎症介质，其在血清中水平升高可促进肝癌多个阶段的进展，与HCC的发生、发展具有重要联系。研究表明[17]，IL-6水平升高是人类病毒性肝炎向肝癌快速进展的有效预测指标之一。IL-6在HCC患者根治性手术前血清中的表达上升可反映出肿瘤的局部炎症反应严重,可能存在肿瘤炎性浸润导致肿瘤突破包膜并蔓延至包膜外侧,肿瘤目前已经处于扩展期，导致进展期肝癌患者术后的不良预后[18]。由此可见，miRNA-155与IL-6的高表达均与HCC的不良预后有关，二者存在着正相关关系，miRNA-155可能通过调控免疫应答系统进一步调节IL-6水平，共同参与HCC的术后进展。因此，可见血清miRNA-155与IL-6的较高表达均会增加HCC患者术后复发或转移的风险，导致预后不良。本研究ROC曲线分析结果显示，血清miRNA-155、IL-6表达量联合预测HCC患者预后不良的ROC曲线下面积明显高于两项指标单独预测的ROC曲线下面积，表明血清miRNA-155联合IL-6水平检测对于HCC患者预后的评估价值更高，可能作为评估HCC患者不良预后的新指标。临床上可在术前联合检测二者指标水平,评估患者预后的情况，及早制定术后干预措施，以改善患者预后。

综上所述,血清miRNA-155、IL-6水平在HCC预后不良患者血清中呈较高表达，二者联合检测对于HCC患者预后具有较好的评估价值，可能作为临床上评估HCC患者不良预后的分子标志物。