脑脊液流式细胞学在鉴别诊断小儿急性淋巴细胞白血病并中枢神经系统白血病中价值

陈东玉，党惠兵，臧玉柱，周可树

（1.方城县人民医院血液肿瘤科，河南 南阳 473200；2.南阳医专一附院血液科，河南 南阳 473200；3.河南省人民医院血液科，河南 郑州 450000；4.河南省肿瘤医院血液科，河南 郑州 450000）

急性淋巴细胞白血病 （Acute lymphoblastic leukemia，ALL）是儿童常见的恶性肿瘤性疾病，约占儿童白血病的70%，随着化疗及分层治疗的完善，约80%的儿童可获得较长生存期[1]。但中枢神经系统白血病的发生可导致患儿死亡率增加，生存期缩短,也是多数ALL患儿治疗失败的主要原因之一[2]。早期诊断中枢神经系统白血病可及时处理和治疗，改善患儿生存期[3]，但目前其诊断主要依靠脑脊液脑脊液细胞学（Cerebrospinal fluid cytology，CC）检查中异型白细胞，CC检查常受到标本及制片等人为影响,仍存在部分中枢神经系统白血病漏诊[4]，提高中枢神经系统白血病检出率是临床亟待解决难题。因此本研究观察脑脊液流式细胞学检查（Flow cytometry，FCM）在鉴别诊断小儿ALL并中枢神经系统白血病中价值。

1 资料与方法

1.1 患儿资料 选取2013年6月30日至2018年6月30日本院收治的98例首诊ALL患儿。选取标准：在我院首诊为ALL，既往未接受其他白血病相关治疗；符合ALL诊断标准[5]；临床资料完整；患儿家属对研究知情且签署本研究相关同意书。排除合并自身免疫性疾病、其他血液系统疾病（如骨髓增生异常综合症等）、先天性疾病、慢性肝脏疾病、慢性肾脏疾病、心脏病、内分泌疾病患儿。

1.2 中枢神经系统白血病诊断标准 可存在中枢神经系统临床特征：头痛、抽搐、呕吐、视网膜出血、口角歪斜、视物模糊以及视乳头水肿等；脑脊液细胞学检查见白血病细胞；排除其他疾病（如脑炎）等引起的相似性改变；颅内压＞0.02kPa，脑脊液中白细胞>106/L。中枢神经系统白血病诊断标准参考[6]。

1.3 检测方法 患儿均接受腰椎穿刺取脑脊液样本,要求一次成功，避免穿刺损伤对样本造成影响。对脑脊液样本进行常规生化检测。取第一次脑脊液检查的标本进行FCM和CC检查。

1.3.1 CC检测方法 取0.1ml脑脊液样本吹打混合均匀，放入离心管，离心1min（200×g），制作脑脊液涂片，并进行瑞氏染色，待自然晾干后放于显微镜下观察涂片中细胞形态。CC阳性指涂片中见幼稚原始白血病细胞，否则为阴性。

1.3.2 FCM检测方法 取约2ml脑脊液样本，离心后取沉淀细胞放入试管中，加入红细胞裂解液。根据免疫分型结果（初诊时免疫表型表达最强者）选择20μl单克隆抗体（美国BD公司提供）加入试管中，室温避光15min后加PBS定容，进行FCM检测。患儿均使用CD34及CD45单抗标记。FCM阳性指脑脊液未被血液污染且可检测到白血病细胞免疫表型或脑脊液混血后白血病细胞免疫表型高于外周血中幼稚细胞，否则为阴性。

1.4 观察指标 ⑴两种检测方法对异形细胞的检出率。⑵两种检查方法对CNS状态的检出情况，根据患儿临床表现、影像学结果及CC结果将ALL分为CNS-1、CNS-2、CNS-3。CNS-1指CC阴性且无CNS相关临床及影像学表现；CNS-2：腰穿无损伤时CC检测中白细胞数≤5/μl，且可见白血病细胞，腰穿损伤时CC检测结果可见白血病细胞或血性脑脊液中白细胞数>50×109/L；CNS-3：CC阳性或出现CNS相关临床及影像学表现。⑶两种方法对脑压增高患儿、脑脊液蛋白阳性患儿、脑脊液血糖增高患儿异常细胞的检出率。⑷根据患儿病情、年龄、白细胞数、化疗反应、微小残留病、激素预治疗反应、免疫分型等将患儿分为标危、高危及中危[6]，比较两种方法对标危、高危及中危的检出情况。

1.5 统计学方法 采用SPSS 23.0分析数据，FCM和CC检出率比较使用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患儿资料98例ALL患儿年龄3～14岁，平均（6.5±2.1）岁，男51例，女47例，随访时间12～42月，中位随访时间32个月，死亡14例，复发8例，4例放弃治疗。共4例患儿确诊为中枢神经系统白血病，其中3例FCM阳性且CC阳性，1例FCM阴性且CC阴性。特殊融合基因Tel/AML1 15例，Bcr/ab1 p210 2例，Bcr/ab1 p190 5例，TKD 2例，MLL/AF4 5例。

2.2 FCM和CC对异形细胞的检出率FCM检出24例患儿脑脊液中存在异形细胞,检出率为24.5%；CC检出11例患儿脑脊液中存在异常细胞，检出率为11.2%，FCM对异形细胞检出率高于CC，差异有统计学意义（P＜0.05），表1。

表1 FCM和CC对异形细胞的检出率

2.3 FCM和CC对不同患儿异形细胞的检出率在脑脊液蛋白质阳性、脑压升高、脑脊液血糖增高患儿中，FCM对异形细胞的检出率均高于CC患儿，差异有统计学意义（P＜0.05）。而两种检查方法在脑脊液蛋白质阴性、脑压正常、脑脊液血糖正常患儿中对异形细胞的检出率差异无统计学意义（P>0.05），表2。

表2 FCM和CC对不同患儿异形细胞的检出率

2.4 FCM和CC对CNS状态及危险度的检出情况FCM和CC阳性患者CNS状态及危险度分布差异无统计学意义（P＜0.05），但FCM对CNS-1、中度患者检出率高于CC，差异有统计学意义（P>0.05）。表3。

表3 FCM和CC对CNS状态及危险度的检出情况

3 讨论

中枢神经系统白血病是小儿ALL治疗失败和疾病进展的重要因素，早期诊断和治疗可提高生存期、降低患儿死亡率[7,8]。中枢神经系统白血病的诊断依赖于脑脊液CC检查发现白血病细胞，但脑脊液中白血病细胞数量较少，且容易受到人为因素的影响，诊断检出率仍待提高[9]。目前FCM已被AIEOP-BFM共识指南（2016年）推荐用于儿童ALL诊断中，但其在诊断中枢神经系统白血病中价值有待研究[10]。

本研究共纳入98例ALL患儿，共4例患儿确诊为中枢神经系统白血病，发病率为4.0%，既往研究报道，ALL发生中枢神经系统白血病几率为2.0%～6.6%，本研究与既往研究报道相符[11]。本研究中4例中枢神经系统白血病患儿中3例FCM阳性且CC阳性，1例FCM阴性且CC阴性，提示FCM和CC诊断中枢神经系统白血病检出率差异不大，由于本研究病例数较少，中枢神经系统白血病发病率低，该结论仍需进一步证实。1例FCM阴性且CC阴性可能与该患儿脑膜未被肿瘤细胞浸润造成。

既往研究报道，FCM在成人ALL患者中枢神经系统受累的诊断效果优于传统细胞学检查，敏感性更高[12]。本研究结果显示，FCM对异形细胞检出率（24.5%）高于CC（11.2%），且在脑脊液蛋白质阳性、脑压升高、脑脊液血糖增高患儿中，FCM对异形细胞的检出率显著高于CC患儿,提示FCM在鉴别诊断小儿ALL并中枢神经系统白血病中价值优于CC，尤其是脑脊液蛋白质阳性、脑压升高、脑脊液血糖增高患儿中。谭惠珍等[13]研究报道，FCM检查诊断ALL中枢神经系统疾病的敏感性高于CC，FCM联合CC可提高ALL中枢神经系统浸润的检出率。Quijano等[14]研究证实，FCM可使ALL中枢神经系统浸润患儿脑脊液中异型细胞的检出率提高75%，本研究也证实FCM对异形细胞检出率更高，与既往研究结果相符。董德明等[15]研究结果显示，FCM脑脊液检测对中枢神经系统浸润检出率高，尤其是脑压增高患儿，与本研究结果相符。

本研究中，FCM和CC阳性患者CNS状态及危险度分布差异无统计学意义（P<0.05）,提示FCM和CC阳性对CNS状态及危险度分布诊断价值相当，但FCM对CNS-1、中度患者检出率高于CC，提示FCM对CNS-1及中度危险患儿的敏感性更高。而FCM对CNS-2、CNS-3敏感性与CC相当。杨文钰等[6]研究证实，脑脊液FCM是CC检查的重要补充,对CNS-2、CNS-3检出能力与CC具有高度一致性，与本研究结果相符。但由于本研究为单中心研究，且中枢神经系统白血病发病率低，病例数有限，研究结果仍待进一步证实。

综上，FCM在鉴别诊断小儿ALL并中枢神经系统白血病中价值优于CC，尤其是脑脊液蛋白质阳性、脑压升高、脑脊液血糖增高患儿，且对CNS状态及危险度的敏感性高。