抗PLA2R抗体在特发性膜性肾病血栓易感状态中的作用研究

茹彦海，徐家云，赵富利

（河南科技大学第一附属医院 1.肾脏内科；2.全科医学科，河南 洛阳 471000）

特发性膜性肾病（IMN）是成人原发性肾小球疾病的常见病理类型之一，患者的临床表现各异，预后差异很大，某些情况下可以自行缓解，近一半的患者最终进入慢性肾功能衰竭[1,2]。血栓形成的发生是肾病综合征的严重并发症，并且是影响患者预后和疗效的最危险因素[3]。目前IMN患者血栓栓塞的机制研究较少。IMN的诊断主要基于肾脏穿刺的病理活检，但肾穿刺活检通常具有某些禁忌症和并发症[4]。抗M型磷脂酶A2受体（PLA2R）抗体于2009年被BEcK等人在成人IMN患者的血液中发现，其水平与患者蛋白尿的增加和减少有关，可能是重要的IMN的靶抗原[5]。但是抗PLA2R抗体是否为IMN的致病性自身抗体目前尚不清楚。为了探讨血清PLA2R抗体与IMN血栓易感状态的关系本研究选取我院收治的86例IMN患者进行研究。

1 资料与方法

1.1 资料 选取我院收治的86例特发性膜性肾病患者作为研究对象，检测两组的血清抗PLA2R抗体，分为抗PLA2R抗体阳性患者40例（阳性组）、抗PLA2R抗体阴性患者46例（阴性组），患者收集时间2019年9月至2021年6月。纳入标准：⑴特发性膜性肾病的诊断标准参考人民卫生出版社《内科学》第七版中的标准[6]；⑵患者临床表现为肾病综合征或蛋白尿、血尿等；⑶实验室检查患者24h尿蛋白定量≥3.5g，血浆白蛋白＜30.0g/L，患者伴有高脂血症、水肿；⑷患者经过肾脏穿刺病理学检查确诊，病理分期参照Ehrenreich标准：Ⅰ～Ⅲ期；⑸本研究符合医学伦理相关要求，对涉及患者隐私的相关资料保密。排除标准：⑴继发性膜性肾病（免疫系统疾病、感染性或寄生虫相关疾病、药物或毒素因素）；⑵精神疾病、阿尔茨海默病；⑶恶性肿瘤；⑷肾结核；⑸肾移植、IgA肾病患者。

阳性组，年龄29～72岁，平均47.0±11.9岁，男26例、女14例；Ehrenreich标准Ⅰ期12例、Ⅱ期22例、Ⅲ期6例；患者体质量22.9±2.2kg/m2；收缩压（SBP）/舒 张 压（DBP）121.0±7.9/73.0±6.0mmHg。阴性组，年龄27～69岁，平均46.3±9.5岁，男26例、女20例；Ehrenreich标准Ⅰ期14例、Ⅱ期26例、Ⅲ期6例；患者体质量22.7±2.4kg/m2；SBP/DBP 123.1±8.4/71.8±7.4mmHg。两组患者的年龄、性别等上述基线资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 抗PLA2R抗体检测 使用欧蒙公司抗磷脂酶A2受体抗体IgG检测试剂盒（酶联免疫吸附法)检测，采集患者的肘部静脉血5ml，1000r/min离心10min，取上清液待测。密封袋中取出实验板条，空白孔中加入样品或者稀释液(1：100稀释)100μl/孔，检测孔中加入标本100μl/孔，胶纸封闭实验表条孔，36℃条件下孵育60～90min，磷酸盐缓冲液清洗5次，空白对照孔中加入生物素抗体稀释液100μl，检测孔中加入生物素抗体检测液100μl，胶纸封闭实验表条孔，36℃条件下孵育30～60min，空白对照孔中加入酶结合稀释液100μl，检测孔中加入酶结合检测液100μl，胶纸封闭实验表条孔，磷酸盐缓冲液清洗5次，加入TMB显色底液（品牌：YSRIBIO湖州英创生物科技公司），避光36℃孵育15min，加入终止液100μl，3min内检测OD450值，BioTek酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司。

1.2.2 凝血功能检测 抽取患者3ml空腹静脉血，加入浓度为129mmol/L柠檬酸钠抗凝管中并混合，在3000r/min下离心10min分离血浆，冷冻保存于-20℃，用双抗体夹心ELISA检测所有血浆D-二聚体（DD），凝血酶原时间（PT），活化部分凝血活酶时间（APTT），纤维蛋白原（Fig）和凝血酶时间（TT）。

1.2.3 TEG检测 采用TEG检测两组患者的血样开始检测到初始血凝块形成所需时间（R值）、初始血凝块形成到达一定强度所需时间（K值）；纤维蛋白凝块形成及加固的速率（Angle角）；主要反应血小板的功能和数量（Ma值）、凝血指数（CI）、Ma值确定后30s纤维蛋白的溶解率（LY30）。

1.2.4 肾功能检测 主要检测两组的24h尿蛋白定量、血肌酐（Scr）、尿酸（UA）、血浆白蛋白（ALB）。用溴甲酚紫法检测患者的ALB，用酶法（CHOD-PAP法）检测UA，用苦味酸法检测Scr，用考马斯亮蓝法检测24小时尿蛋白，试剂盒由上海纪宁生物科技有限公司提供，相应步骤根据对应说明书进行。

1.3 统计学处理 统计分析采用SPSS 21.0软件，两组患者年龄、24h尿蛋白定量、Scr、血浆ALB等计量数据采用（）表示，组间对比采用t检验；性别等计数资料组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 阳性组和阴性组的肾功能比较 阳性组患者的24h尿蛋白定量、Scr、血浆ALB高于阴性组（P<0.05）；阳性组和阴性组的UA差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

表1 阳性组和阴性组的肾功能比较（）

表1 阳性组和阴性组的肾功能比较（）

组别n Scr（μmol/L）UA（mmol/L）阳性组阴性组t值P值40 46 24h尿蛋白（g/24h）5.71±1.20 3.26±0.78 11.364 0.000 84.3±17.6 69.2±13.0 4.562 0.000 381.8±97.5 364.5±88.0 0.865 0.390 ALB（g/L）27.41±3.30 30.02±3.85-3.349 0.001

2.2 阳性组和阴性组的凝血功能指标比较 阳性组患者的血浆D-D测定值高于阴性组（P<0.05）；阳性组和阴性组的PT、APTT、Fig、TT测定值差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

表2 阳性组和阴性组的凝血功能指标比较（）

表2 阳性组和阴性组的凝血功能指标比较（）

组别 n D-D（mg/L） PT（s） APTT（s） Fg（g/L） TT（s）阳性组阴性组t值P值40 46 0.34±0.11 0.17±0.10 7.506 0.000 12.61±1.04 12.40±0.84 1.035 0.303 28.51±3.30 29.04±2.75-0.812 0.419 4.10±0.81 3.82±0.72 1.697 0.093 16.48±1.73 16.20±1.55 0.792 0.431

2.3 阳性组和阴性组的TEG参数比较 阳性组患者的CI值、LY30测定值高于阴性组（P<0.05），阳性组的R值低于阴性组（P<0.05），阳性组和阴性组的K值、Angle角、Ma值、差异无统计学意义（P>0.05），见表3。

表3 阳性组和阴性组的TEG参数比较（）

表3 阳性组和阴性组的TEG参数比较（）

组别 n R值（min） K值（min） Angle角（°） Ma值（mm）阳性组阴性组t值P值40 46 4.88±1.20 5.68±1.17-3.125 0.002 1.46±0.34 1.53±0.31-0.998 0.321 70.52±6.61 68.27±5.59 1.710 0.091 62.81±5.77 64.03±5.59-0.995 0.323 CI 1.33±0.38 1.04±0.32 3.842 0.000 LY30（%）0.38±0.11 0.19±0.09 8.807 0.000

3 讨论

IMN是成人慢性肾脏疾病的主要原因之一，是抗体介导的自身免疫性疾病，患者肾小球内脏层中免疫复合物逐渐沉积，导致基底膜弥漫性增厚,多达40%至50%的患者在15年内会发展为终末期肾脏疾病[7,8]。在IMN分子发病机制中足细胞自身抗原的鉴定方面已取得重要进展。PLA2R是存在于人肾小球足细胞膜上的跨膜糖蛋白，与相应的蛋白质形成免疫复合物，沉积在肾小球上以进一步激活补体形成，从而导致足细胞疾病[9]。血栓形成的发生与许多因素有关，通常与血液粘度，血流缓慢和血管内皮损伤有关。在先前的临床研究中，IMN中血栓形成的独立危险因素是低蛋白血症，蛋白尿和其他指标[10]。

相关研究表明[11],与24h尿蛋白相比,PLA 2R抗体水平是更好的尿液活动指标，可以及时响应疾病活动。血清PLA2R抗体阳性患者的蛋白尿和低白蛋白血症更为严重。本次研究结果显示阳性组患者的24h尿蛋白定量、Scr、血浆ALB明显高于阴性组。提示IMN患者血清中PLA2R抗体的表达与患者白蛋白和尿蛋白之间存在一定的相关性。主要原因是当PLA2R与抗体结合时，形成的免疫复合物积聚在肾小球基底膜上。随着临床分期加重，血清肾功能指标的增加也表明肾功能严重受损。

血栓形成与外科手术创伤，血管内出血引起的血管内皮损伤和凝血病密切相关[12]。PT，APTT，Fg和TT是临床凝血功能判断的常规测量项目，是在手术前筛查异常凝血功能的强制性项目，在临床疾病的诊断和治疗中具有重要价值[13]。本次研究结果显示，阳性组患者的血浆D-D测定值明显高于阴性组，PT、APTT、Fg、TT测定值差异无统计学意义。这可能是由于阳性组患者的止血时间延长，凝血功能紊乱。

常规的凝血项目只能检测到凝血过程的某个阶段或某个组成部分，灵敏度较低，只能单方面反映凝血功能的变化[14]。 研究表明[15,16]，当凝血因子降低至正常值的30%至50%时，凝血酶原时间和活化的部分凝血活酶时间会明显改变。血栓弹力描记术（TEG）可以动态监测全血凝结的全过程，是及时检测血液高凝性的有效和可靠的指标之一[17]。R值反映了凝血因子参与凝血起始阶段的作用。MA值主要反映血小板的聚集功能，其大小受纤维蛋白原和血小板的影响，MA值增加表明血小板聚集增加和血小板功能亢进。LY30反映了纤溶功能;CI可以确定凝血和出血的综合状态[18]。本次研究中，阳性组患者的CI值、LY30测定值明显高于阴性组，阳性组的R值明显低于阴性组，其原因是阳性组中凝血因子的数目显著增加或者凝血功能增强，并且主要是内源性凝血因子。由于血小板在静脉血栓形成中不发挥主要作用，因此它们仅发挥其功能的一部分。在这项研究中，阳性组和阴性组的Ma值均无显著变化，表明患者血小板的数量和功能没有显著变化。

以往研究[19,20]中对IMN的研究主要集中于对抗PLA2R抗体阳性和阴性表现患者肾功能指标的研究，显示IMN患者伴有明显的肾功能不全。基于此，本研究增加了对凝血相关指标的研究，并且应用TEG检测，通过血小板数量，功能和纤维蛋白溶解的变化来反映凝血功能。结果表明在血液循环中血循环中抗PLA2R抗体阳性的IMN患者与具有阴性抗体的患者相比，血栓形成的发生率更高。

综上所述，抗PLA2R抗体阳性IMN患者的凝血相关指标与抗PLA2R抗体阴性患者存在显著差异，其发生血栓的风险增高。