基因芯片技术在耐药结核病临床诊断中的应用价值研究

冯刚

（连云港市第四医院检验科，江苏 连云港 222000）

耐药结核病是全球性公共卫生问题[1]。据世界卫生组织估算,全球每年约有37.8万例新发耐多药结核病[2]。中国是耐药结核病高负担国家，每年大概新发11万耐多药结核病[3]。利福平与异烟肼是目前抗结核的主要一线药,其耐药性检测对结核病患者的治疗有重要意义[4]。传统比例法药物敏感性试验诊断结核病耐药性,虽灵敏度较高但实验周期较长[5,6]，往往需要数月时间，不能满足临床诊断需求[7]。因此，快速耐药检测技术的应用是当前结核病控制的关键[8]。

基因芯片方法利用基因杂交技术,通过检测标本中结核分枝杆菌rpoB、katG/inhA基因,可以在8h内判定其对利福平及异烟肼两种抗结核药物的耐药性[9,10]。研究报道基因芯片方法诊断结核病耐药性的灵敏度和特异性高,适用于耐药结核病临床诊断[11]。本研究通过用该方法在连云港四院检测肺结核患者阳性痰标本,检测是否含有结核分枝杆菌及其对利福平和异烟肼的耐药性,初步分析该技术的检测效能，探讨其在地市级临床结核病实验室的推广应用价值。

1 对象与方法

1.1 研究对象 连续纳入2016年1月-2018年12月连云港地区各区县发现的所有肺结核病例，共有2018例涂片阳性患者的痰样本运送到连云港第四医院进行后续检测分析。详细记录从痰样本留取到实验室检测的时间。

1.2 方法

1.2.1 痰标本处理 痰标本采用N-乙酰-L半胱氨酸-NaOH(NALC—NaOH)消化液处理，使用磷酸盐缓冲液中和离心后，倾倒磷酸盐缓冲液并重悬菌液沉淀至2ml，备用。

1.2.2 培养 取0.1ml标本消化液接种2支罗氏中性固体培养基，37℃恒温培养箱培养4～8周观察结果，培养阳性菌株用于药物敏感性试验。

1.2.3 比例法药物敏感性试验 采用比例法将培养阳性分离菌株研磨制成1mg/ml的混悬液,再分别稀释至10～2mg/ml和10～4mg/ml,分别使用22 SWG标准接种环挑取一满环（即0.01ml）的混悬液接种至含利福平和异烟肼的培养基中，用相同方法接种对照组培养基。置于36±1℃条件下连续培养4周后观察结果，计数培养基上的菌落数并计算耐药率。耐药率（%）＝（含药培养基上生长的菌落数／对照培养基上生长的菌落数）×100%。耐药率＜1%为敏感，耐药率＞1%为耐药。

1.2.4 基因芯片耐药检测 取1ml经4%氢氧化钠处理后的消化液加入1.5ml离心管中,以12000r/min离心5min，弃上清液后加1ml磷酸盐缓冲液，震荡混匀后以12000r/min离心5min，弃上清液后加入80μl核酸提取液，充分混匀，然后移入核酸提取管中，旋涡振荡充分混匀，置于超声震荡仪中处理5min，95℃干浴15min，12000r/min离心1min备用。按试剂盒操作说明进行PCR扩增、芯片洗涤干燥、芯片杂交、芯片扫描和结果判读等。

1.3 数据分析 采用SPSS 22.0软件对结果数据进行统计学处理,采用四格表的形式计算敏感度和特异度,评价基因芯片检测对利福平和异烟肼耐药性的检测效能。差异检验经配对卡方检验（McNemar Test），P<0.05为差异有统计学意义。还使用Cohen的kappa（κ）系数评估了传统药敏实验与基因芯片技术之间的一致性程度，κ>0.75表示这两种方法的一致性非常好，0.4<κ<0.75表示这两种方法的一致性良好。κ<0.4表示这两种方法的一致性较差。

2 结果

2.1 病历纳入情况 对收集的2018例涂阳病例的痰标本进行培养，341例培养阴性（16.9%）,17例污染（0.8%）。1660例培养阳性样本进行比例法药敏试验，241例非结核分枝杆菌，8例结果无法判读，1411例获得耐药结果。2018例病例的涂阳痰样本进行基因芯片检测，201例为非结核分枝杆菌（10.0%）,155例结果无法判读（7.7%），1662例获得耐药检测结果。

2.2 基因芯片检测痰标本中结核分枝杆菌对利福平的耐药性分析 以固体药敏试验为标准，共计有1333例可以进行基因芯片耐药检测对比分析。基因芯片检测利福平耐药的灵敏度和特异度分别为82.1%和97.5%。见表1。

表1 基因芯片检测利福平耐药的效能分析

2.3 基因芯片检测痰标本中结核分枝杆菌对异烟肼的耐药性分析 以固体药敏试验为标准，共计有1333例可以进行基因芯片耐药检测对比分析。基因芯片检测异烟肼耐药的灵敏度和特异度分别为76.8%和96.0%。见表2。

表2 基因芯片检测异烟肼耐药的效能分析

2.4 基因芯片检测失败样本分析2018例涂阳痰样本全部进行基因芯片检测，155例耐药检测结果为无分枝杆菌或无法判读（7.7%）。其中85.8%的样本涂片结果分布在2+以下。见表3。

表3 基因芯片检测失败样本涂片结果分布

3 讨论

目前越来越多的新检测技术可进行结核病及耐药结核病的早期诊断和鉴定,每种检测技术各有利弊[12-14]。基因芯片法耐多药试剂可直接用于痰液及其他多种临床标本中的结核分枝杆菌耐药性检测。

基因芯片法不仅能用于结核分枝杆菌的鉴定,且相对于传统比例法极大地缩短了结核分枝杆菌耐药性检测的时间。据相关文献报道[15-17]，以比例法药敏实验结果为判断标准,检测利福平耐药性的灵敏度和特异度分别为84.4%和97.7%，检测异烟肼耐药性的灵敏度和特异度分别为80.9%和97.4%。本次研究结果显示，基因芯片检测利福平耐药的灵敏度、特异度和kappa分别为82.1%、97.5%和0.67。基因芯片检测异烟肼耐药的灵敏度、特异度和kappa分别为76.8%、96.0%和0.65，两种方法的结果显示出良好的一致性。效能结果与其它文献所示数据接近[18]，提示基因芯片法检测结核分枝杆菌对利福平及异烟肼的耐药性具有较好的灵敏度和特异度，亦有较好的重复性。

研究报道，基因芯片检测的灵敏度与标本中分枝杆菌的数量呈正相关[19]。本次试验中有155例(7.7%)样本基因检测结果失败，其中99例样本检测为无分枝杆菌,提示基因芯片法实验成功与否还与标本中存在的分枝杆菌实际数量有关，155例样本中有133例标本涂片镜检阳性程度较低（≤2+）。

基因芯片法可以同时检测利福平和异烟肼两种抗结核药物的耐药性,故此法亦可用于耐多药肺结核患者的快速诊断。与传统比例法药敏实验相比，基因芯片法具有以下优点:⑴基因芯片技术具有分子生物学的高灵敏度,同时结合了生物芯片技术的高通量性,相对于比例法大大缩短了检测时间,能够在8h内完成结核分枝杆菌耐药性检测，因此可以更早地为临床医生制定用药方案提供实验依据[20]，并缩短了实验室工作人员的操作时间;⑵本方法是针对结核分枝杆菌核酸进行检测分析，并不需要对大量活菌进行实验操作，因此，此方法比传统比例法药敏试验更安全。但基因芯片法亦有一定的缺点，操作流程较比例法药敏试验更为繁琐，因此对实验室操作人员的技术要求更高，且设备价格昂贵，检测试剂、耗材的成本较高，对实验室环境也有较高的要求。

综上所述，初步研究结果表明相对于传统比例法药敏实验基因芯片检测周期短，操作相对复杂，在检测结核分枝杆菌同时可以准确检测利福平和异烟肼的耐药性，对结核病尤其是耐多药结核病的早期诊断和治疗具有十分重要的意义。