艰难梭菌肠道感染BALB/c小鼠模型的建立及简易评价

王文娟，胡志坚，何巍巍，欧阳良良，梁晓君

（九江学院附属医院检验科，江西 九江 332000）

艰难梭菌 （Clostridium difficile,C.difficile）属革兰氏阳性厌氧芽孢杆菌，在自然环境中广泛存在；是医院内抗生素相关感染性腹泻的主要病因。在肠道定植的艰难梭菌可产生两种外毒素，毒素A和B。毒素可导致急性炎症、细胞坏死和肠道液体分泌[1-3]。近年来，在美国由艰难梭菌感染导致的死亡率增长迅猛[4]。通常情况下，只有当肠道正常菌群被破坏后，比如使用抗生素治疗其他疾病的过程中，艰难梭菌才会造成感染发病[5,6]。因此，艰难梭菌感染已成为住院病人高发传染病。而抗生素治疗对艰难梭菌感染大多无效[7]。目前，治疗艰难梭菌相关疾病（Clostridium difficile-associated disease,CDAD）的方法是尽可能停用导致疾病发生的抗生素，辅助以万古霉素或甲硝唑进行治疗。但治疗方法无法重建肠道正常菌群对艰难梭菌感染的抑制，也无法阻止艰难梭菌芽孢的产生[8]。

CDAD在多种动物模型中进行研究，如仓鼠、豚鼠、无菌小鼠和大鼠等[9-12]。仓鼠是最常使用的动物模型，经抗生素处理之后，艰难梭菌可在仓鼠肠道定植并诱发CDAD。但仓鼠发病的主要部位在盲肠，动物发病后会发展为腹泻，并因急性炎症而快速死亡。该模型可模拟快速发病并致死疾病类型，但与人体CDAD通常病程存在很多不同。实验室常用的正常状态的小鼠和大鼠不易感染艰难梭菌，但艰难梭菌可以在无菌小鼠和大鼠的肠道定植并发展成假膜性结肠炎，且与人体感染更为类似[13-15]。但无菌小鼠或大鼠的获取价格昂贵，并不适合实验室常规使用。

因此，本研究拟建立实验室常用小鼠感染艰难梭菌模型，为后续研究艰难梭菌感染及治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 艰难梭菌ATCC 43255购自美国模式菌种保藏中心ATCC（American Type Culture Collection）。BALB/c小鼠（雌，14～16g），购自江西省中医药大学实验动物中心。脑心浸液（干粉）购自BD公司 （BD Biosciences,237400），CCFA琼 脂 基 础（HB8808）和50%卵黄乳液（HB8295）购自青岛海博生物技术有限公司，环丝氨酸（239831）和头孢西丁钠（C4786）购自Sigma公司。厌氧培养箱购自上海康华生化仪器公司。氨苄西林（59349）、链霉素（1203008）、万古霉素（V2002）购自Sigma公司。

1.2 动物处理及感染BALB/c小鼠随机分成4组，每组10只，一组作为对照（不经抗生素处理），另3组分别使用不同抗生素进行处理。氨苄西林（0.5mg/ml）、链 霉 素（5mg/ml）及 万 古 霉 素（0.1mg/ml）添加入小鼠饮水中，小鼠自由饮水，处理5天。

1.3 艰难梭菌培养及感染 将艰难梭菌ATCC 43255划线接种于CCFA平板（CCFA琼脂基础10.6g，加水定容至200ml，高压灭菌后加入50%卵黄乳液10 ml，环丝氨酸0.1g，头孢西丁3.2mg），于厌氧培养箱中培养，挑取单菌落接种于BHI培养液培养过夜。然后取培养液涂布于血平板，厌氧培养5天以促使艰难梭菌芽孢产生。用无菌PBS将菌苔冲洗下平板，65C孵育2小时。芽孢经无菌PBS冲洗3次，经连续稀释后涂布CCFA平板，定量芽孢数目（以CFU计数）。

小鼠经抗生素饮用水处理5天，随即换普通饮水1天。然后经口腔灌胃103 CFU艰难梭菌。剩余菌经连续稀释后涂板定量计数，以确定接种菌量准确。

1.4 样品采集和检测指标 感染后24h，收集艰难梭菌感染后小鼠的粪便样本并称重，用PBS溶解后逐级稀释，取不同梯度稀释液涂布于CCFA平板，厌氧培养，计数芽孢菌数量。观察小鼠死亡情况，绘制艰难梭菌感染后小鼠的生存曲线。

2 结果

2.1 小鼠的抗生素处理及感染 我们选取了临床上经常使用的抗生素来破坏小鼠肠道正常菌群，观察抗生素处理后小鼠对艰难梭菌的易感程度。将不同抗生素按如下浓度溶解于小鼠饮用水中，氨 苄 西 林0.5mg/ml，链 霉 素5mg/ml，万 古 霉 素0.1mg/ml，小鼠自由饮水，处理5天。之后换成未添加抗生素的饮用水处理一天，随后进行艰难梭菌感染。

2.2 不同抗生素处理的小鼠感染艰难梭菌后细菌载量的变化 经抗生素处理过的小鼠感染艰难梭菌24h后，取小鼠粪便，溶解于无菌PBS，经连续逐级稀释后，涂布于平板，计数小鼠粪便艰难梭菌数量。实验共计3次，计算菌落平均数。如图1所示，链霉素处理后小鼠粪便中艰难梭菌含量最高，可达8.2107 CFU/g；氨苄西林处理的小鼠粪便中也可检测到较高的艰难梭菌载量，可达1.5107 CFU/g；万古霉素处理的小鼠粪便中检测到的细菌载量很低，平均为3.6106 CFU/g。

图1 不同抗生素处理小鼠感染艰难梭菌24h后粪便艰难梭菌载量（CFU/g）。ND，未检测到。

2.3 不同抗生素处理的小鼠感染艰难梭菌后生存曲线 小鼠经不同抗生素处理5天，换为正常饮水1天后，用103 CFU艰难梭菌芽孢进行感染，每天观察记录动物死亡状况，绘制艰难梭菌感染后小鼠生存曲线。如图2所示，经链霉素处理的小鼠，从感染后第2天起即出现死亡，至感染后第6天全部小鼠均死亡；经氨苄西林处理的小鼠，从感染后第3天出现死亡，至感染后第8天有60%的小鼠死亡；经万古霉素处理的小鼠，至感染后第8天有20%的小鼠死亡；未经抗生素处理的小鼠，均存活。

图2 不同抗生素处理的小鼠感染艰难梭菌后生存曲线

3 讨论

艰难梭菌感染在发达国家越来越受重视，其发病率和死亡率在近些年来都在上升，美国每年由艰难梭菌导致的死亡病例多达14000例[16]；在国内也引起越来越多关注。艰难梭菌感染往往发生在抗生素破坏肠道正常菌群后，因此，常规抗生素不能用来治疗艰难梭菌感染。临床成功使用肠道菌群移植的方法治疗艰难梭菌感染，提示了肠道正常菌群在对抗艰难梭菌感染中发挥重要作用。实验室简单、易用的艰难梭菌感染动物模型的缺失是制约艰难梭菌深入研究的一个因素，因此，本研究拟建立艰难梭菌感染的小鼠模型。

以往研究发现使用头孢哌酮、克林霉素、替加环素或多种抗生素联合用药处理C57BL/6小鼠，可增强其对艰难梭菌的易感性[17,18]。本文考察临床常用的链霉素、氨苄西林和万古霉素是否可破坏肠道正常菌群、提高小鼠对艰难梭菌的易感性。通过使用三种临床常用的抗生素处理小鼠，破坏小鼠肠道正常菌群，观察不同抗生素处理的小鼠对艰难梭菌的易感性变化。结果发现，经链霉素处理后的小鼠对艰难梭菌感染最易感，经氨苄西林处理的小鼠易感性次之，经万古霉素处理的小鼠对艰难梭菌易感性较差，而未经处理的小鼠对艰难梭菌不易感。成功建立的艰难梭菌感染小鼠动物模型，为研究肠道菌群在对抗艰难梭菌感染中的作用及机制、艰难梭菌感染预防治疗方案的评价等奠定了基础。