基于MRM-IDA-EPI技术筛查猪尿中4种β-受体激素残留

汤逸飞，屠雨晨，陈欣慰，黄 芳，张国平

（嘉兴市农业综合检验检测中心，浙江 嘉兴 3140501）

在我国，克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林等β受体激素已被禁止使用[1]。当高剂量使用这类β受体激素时，虽然隐形添加可显著提高猪或其他家畜体质量以及酮体瘦肉率，但其残留物很容易通过食物链进入人体进而危害健康[2]。本研究以猪尿为例，结合快速前处理和超高效液相分离（QuEChERS-UPLC）方法，首次检测端采用多反应监测-信息依赖-增强型质谱扫描（MRM-IDA-EPI）技术靶向同步对4种β受体激素的离子对和碎片离子信息进行识别和分析，降低了猪尿的基质效应对低含量化合物检出的影响，可快速准确地完成对化合物的识别[3]，为猪肉产品质量安全监管和溯源提供有力的技术支撑[4]。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

主要仪器包括液相串联质谱仪（LC-20AD/QTRAP4500，日本岛津公司/美国AB Sciex公司）、ROTINA 420R离心机（德国Hettich公司）和XW-80A旋涡混合器（上海精密科学仪器有限公司）；提取盐试剂包成分为4.0 g硫酸镁，1.0 g氯化镁，1.0 g柠檬酸钠，0.5 g柠檬酸氢二钠；净化离心管成分为150 mg N-丙基乙二胺（PSA），15 mg石墨化炭黑（GCB），885 mg硫酸镁。克伦特罗、莱克多巴胺、沙丁胺醇和特布他林均为有证标准物质；乙腈和甲醇均为色谱级；实验用水为超纯水。

1.2 试验方法

QuEChERS-UPLC条件:量取猪尿10.0 mL，加入10 mL乙腈溶液，加入提取盐试剂包，加入1枚陶瓷均质子，振摇1 min，4 200 rpm，离心5 min。取上清提取液6.0 mL，转移到净化离心管中，涡旋1 min，4 200 rpm，离心5 min。取上清净化液2 mL，氮吹至近干，初始流动相（A:B=95:5）溶液复溶至1.0 mL，0.22μm水膜过滤待测液。色谱柱采用Kinetex Biphenyl柱（2.6μm，2.1 mm×100 mm），流动相A为A（0.2%甲酸+2 mmol/L乙酸铵水溶液），B为甲醇，流速0.5 mL/min，柱温40℃，进待测液1μL。流动相梯度条件为0.1～1.0 min，A:B=95:5；1～4 min，A:B=95:5→40:60；4～8 min，A:B=40:60→36:64；A:B=5:95保持5 min洗柱；A:B=95:5保持5 min平衡。

MRM-IDA-EPI条件:在MRM模式下，正离子电喷雾离子源（ESI+）设定源参数为喷雾电压（Ion－Spray Voltage）5500 V，辅助气1（GS1）55 Arb，辅助气2（GS2）55 Arb，辅助气加热温度（TEM）550℃，气帘气（CUR）35 Arb，碰撞气（CAD）Medium；β-受体激素监测离子对（MRM）解簇电压（DP），碰撞能量（CE）见表1。在相应IDA-EPI模式下，对在离子对响应值超过500 cps的进行EPI质谱扫描，EPI扫描范围m/z50～600，碰撞气（CAD）Low，扫描速率10000Da/s，解簇电压（DP）100 V，碰撞能量（CE）10 eV，其他参数与MRM模式设定一致。

表1 4种β-受体激素在甲醇溶剂中的质量分析参数

2 结果与分析

2.1 空白猪尿基质对数据分析的影响

为充分体现猪尿检测中可能存在的假阳性，对提取离子流色谱图（XIC）进行筛查。XIC结果表明，空白猪尿基质对提取-净化试剂包组合不会产生假阳性。根据在猪尿加标基质中峰形良好，没有杂峰干扰并且响应较大的离子对为定量离子对。猪尿基质中4种β-受体激素相应离子对的离子流（TIC）如图1所示，其中图中编号为表1中对应的4种β-受体激素。

图1 猪尿基质中4种β-受体激素的总离子流

2.2 结构解析

在正离子模式下，对4种β-受体激素离子对进行+MRM-IDA-EPI分析，4种β-受体激素可被准确识别，见图2。该图中的化合物编号与猪尿中鉴定的相关信息与化合物的编号相一致，见表2。4种β-受体激素碎片离子虽然受到猪尿基质影响会出现一些不相关信号，但与文献[5]比较，质谱裂解规律呈现的[M+H]+等特征碎片离子均已识别。

表2 猪尿中MRM-IDA-EPI鉴定的4种β-受体激素相关信息

图2 猪尿中4种β-受体激素定量离子对所对应的XIC图和EPI图

2.3 标准曲线的建立

以质量浓度为横坐标，定量离子峰面积为纵坐标，将配制的0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L和50μg/L系列质量浓度绘制标准曲线。4种β-受体激素线性回归方程、相关系数（r）、检出限（LOD，信噪比S/N≥3）和定量限（LOQ，信噪比S/N≥10）见表3。结果表明，4种β-受体激素在猪尿中0.5～50μg/L的线性范围良好，相关系数r在0.985～0.994之间，检出限在0.07～0.13 ng/mL之间，定量限在0.24～0.44 ng/mL之间。

表3 4种β-受体激素在猪尿中的线性回归方程和相关系数

2.4 回收率试验

采用标准曲线法对加标量分别为0.5 ng/mL，5 ng/mL和50 ng/mL的猪尿空白基质样品进行加标回收试验。低质量浓度（0.5 ng/mL）p%范围为74.12%～112.80%，RSD%为1.75%～14.38%；中质量浓度（5ng/mL）p%范围为73.67%～109.33%，RSD%为0.63%～6.70%；高质量浓度（50 ng/mL）p%范围为62.11%～108.45%，RSD%为0.95%～14.35%。结果表明，该检测方法准确度较好。

表4 4种β-受体激素在猪尿基质中的回收率和相对标准偏差(n=3)

3 讨论和小结

猪尿中定量检测β-受体激素残留是比较常规的检测项目，以往检测仅通过出峰的保留时间（RT）判定阳性，往往容易发生假阳性的情况。本研究建立的方法主要特点是以QuEChERS-UPLC技术为基础，在+MRM-IDA-EPI模式下，既相对满足基质外标法定量的灵敏度、准确度和精密度的要求，又可同步通过EPI结构解析，复核4种β-受体激素[M+H]+等特征碎片离子的检出。该方法可用于猪尿中4种β-受体激素的快速筛查测定，具备农业农村部公告第197号-10-2019相似样品制备和检测灵敏度的特点。