复方血栓通胶囊对老年糖尿病肾病维持性血液透析的治疗效果及作用机制

陈拉斯 王婷婷 李来梅

(海南医学院第一附属医院 1血液净化科，海南 海口 570102；2肾内科；3海南省儿童医院儿科)

糖尿病肾病(DN)是导致终末期肾病的重要原因之一，维持性血液透析虽然能够作为一种代替疗法，提高未进行肾脏移植的终末期肾病患者的长期生存率，但终末期肾衰竭患者的致死率仍然很高，特别是对于老年DN患者而言，由于肾功能及免疫功能降低使得其病死风险较年轻群体更高〔1〕。迄今为止，DN的发病机制尚未完全明确，可能是多因素参与并作用的结果，持续高糖环境所造成的血管新生、氧化应激反应、免疫应答紊乱、持续慢性炎症反应等均与其发病有关〔2〕。中医观点指出，气阴两虚兼血瘀证是DN的主要证型，治疗宜充足气阴，即化瘀活血、养阴益气；缓解痰瘀停滞，即强盛脾肾，保气血通畅。复方血栓通主要成分为三七、丹参和黄芪，主要功效为祛湿化瘀，补益脾肾气阴兼顾，使全身脏腑功能得到活动，从而具备抗菌、消炎、抗氧化、降低炎症复合物沉积及改善肾小球硬化等作用〔3〕。现阶段，在DN早期治疗中常应用复方血栓通，而在DN患者维持性血液透析中应用该药物，目前暂无报道，尤其是对于65岁以上老年群体的研究更为罕见。基于此，本研究通过观察老年DN维持性血液透析患者在复方血栓通治疗前后氧化应激、血管新生因子、Th1/Th2相关细胞因子及核因子(NF)-κB信号通路的变化，初步研究复方血栓通的作用及相关机制，将为更多DN患者的治疗奠定相关实践基础。

1 资料与方法

1.1一般资料 取2017年10月至2019年1月于海南医学院第一附属医院接受维持性血液透析治疗的老年DN患者78例，纳入标准：①西医诊断符合《实用内科学》中的相关标准〔4〕；②中医诊断符合《糖尿病肾病诊断、辨证分型及疗效评定标准》中的气阴两虚型〔5〕；③无合并其他严重躯体及精神疾患者；④年龄≥65岁；⑤透析时间>6个月，病情稳定；⑥患者及家属均自愿参加并签署知情同意书。排除标准：①病情进展需要紧急终止者；②入组1个月前曾接受过降脂、抗凝药物治疗者；③合并严重神经、代谢、内分泌系统疾病者；④不良反应程度重，如对药物过敏、出现严重的消化道反应难以控制；⑤同时伴有恶性肿瘤或其他血液系统疾病的患者；⑥患者重要脏器存在功能障碍，如心、肝、肺。78例患者随机分为治疗组及对照组，每组各39例。治疗组男21例，女18例；对照组男23例，女16例。治疗组年龄65～80岁，平均年龄为(71.12±8.59)岁；对照组65～82岁，平均年龄为(70.51±8.39)岁。治疗组体重45.50～68.39 kg，平均体重为(59.20±8.87)kg；对照组体重44.68～69.29 kg，平均体重为(58.12±8.169)kg。透析时间，治疗组1～14个月，平均时间为(8.20±1.29)个月；对照组1～13个月，平均时间为(8.30±1.19)个月。两组数据间无显著差异(P>0.05)，因此该数据符合继续研究要求。

1.2方法 两组患者给予同样的常规治疗，包括：药物维稳血糖、血脂、血压，纠正电解质紊乱、改善贫血等，同时进行血液透析，高通量透析设备为B.Braun Avitum AG的聚砜膜透析器，透析液为含135～145 mmol/L钠离子、2.0 mmol/L钾离子、1.25～1.50 mmol/L 钙离子的碳酸氢盐溶液。全部透析器配备内毒素过滤器，所有设备不得重复使用。对于透析设备试剂质控如下：透析液细菌菌落数<100 CFU/ml，内毒素<0.25 EU/ml。透析过程设置如下：透析液流量500 ml/min，血流量200～300 ml/min，4 h/次，3次/w。治疗组在此基础上额外加以口服复方血栓通胶囊(广东众生药业股份有限公司，国药准字：Z20030017，规格0.5 g/粒)，每次3粒，每日3次。每组均治疗8 w。

1.3观察指标 ①抽取患者治疗前与治疗后晨起空腹外周静脉血3 ml，血液静置后，以3 000 r/min离心5 min，提取血清并低温环境冻存，以备后续实验。对患者肾功能指标水平进行以下检测：24 h尿蛋白定量(Pr)、血清白蛋白(ALB)、血肌酐(Scr)等，采用美国贝克曼CX7+型全自动生化仪。②提取血清方法同上，检测血清中血管新生因子〔血管生成素(Ang)1、Ang2、血管内皮生长因子(VEGF)〕和Th1/Th2相关细胞因子〔白细胞介素(IL)-4、IL-6、IL-10、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α〕等水平，氧化应激相关产物原花青素(PC)、8-羟基脱氧鸟苷(OHdG)的含量等，以上均应用酶联免疫吸附试验(ELISA)进行检测。丙二醛(MDA)的含量采用硫代巴比妥酸反应物(TBARS)比色法试剂盒测定，全部试剂盒购自上海哈灵生物科技有限公司。③取上述静脉血离心沉淀，采用逆转录-聚合酶链反应法(RT-PCR)测定血浆中p50、p65、人核因子κB抑制蛋白α(IκBα)mRNA、Iκβ激酶β(IKKβ)等NF-κB信号通路相关指标基因表达。参照试剂盒说明书分别提取细胞总RNA，进行逆转录，以逆转录产物cDNA为样本应用实时荧光定量PCR仪进行扩增，管家基因β-actin作为内参，引物设计由Primer软件完成，计算2-ΔΔCt即为目的基因mRNA相对表达水平，引物由生工生物工程股份有限公司合成。见表1。④对患者均保持6个月有效随访，并关注其不良反应发生情况。

表1 Real time-PCR引物序列

1.4统计学方法 采用SPSS22.0软件进行t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1两组肾功能指标水平比较 两组治疗前Pr、Scr、ALB无显著差异(P>0.05)；治疗后，两组Pr、Scr均明显下降，ALB均明显升高，且相较于对照组，治疗组Pr、Scr下降水平显著更低(P<0.01)，ALB升高水平显著更高(P<0.01)。见表2。

表2 两组肾功能指标水平比较

2.2两组氧化应激相关产物水平比较 两组治疗前PC、8-OHdG、MDA水平无显著差异(P>0.05)；治疗后，两组PC、8-OHdG、MDA均明显下降，且相比于对照组，治疗组下降程度更显著(P<0.01)。见表3。

表3 两组氧化应激相关产物水平比较

2.3两组血管新生因子表达情况比较 治疗前，两组Ang1、Ang2、VEGF的表达无显著差异(P>0.05)；两组治疗后Ang1、Ang2、VEGF水平均明显下降，治疗组相较于对照组上述因子降低趋势更为显著(P<0.01)。见表4。

2.4两组NF-κB信号通路相关指标基因表达比较 两组患者p50、p65、IKKβ、IκBα mRNA基因表达水平在治疗前基本无异(P>0.05)；随着两组方案治疗的进行，患者的p50、p65、IKKβ、IκBα mRNA基因表达均明显下降，且通过数据统计发现，治疗组相较于对照组上述基因表达水平降低趋势更为显著(P<0.01)。见表4。

表4 两组血管新生因子及NF-κB信号通路相关指标基因表达比较

2.5两组Th1/Th2相关细胞因子比较 治疗前，两组IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α比较无统计学意义(P>0.05)，治疗后，两组IL-6、IL-1β、TNF-α均明显下降，IL-4、IL-10均明显升高，且相较于对照组，治疗组IL-6、IL-1β、TNF-α下降水平显著更低(P<0.01)，IL-4、IL-10升高水平显著更高(P<0.01)。见表5。

表5 两组Th1/Th2相关细胞因子比较

2.6两组不良反应比较 全部受试者治疗过程中，纳差在治疗组中出现1例，对照组中出现3例；头晕在治疗组中出现1例，对照组中出现5例，对比两组间不良反应发生率有显著性差异(P<0.05)，以上不良反应在积极治疗后得以缓解。

3 讨 论

DN作为糖尿病患者常见的严重慢性微血管并发症之一，具有起病隐患，并可持续数年的特点。早期DN患者仅表现出肾小球滤过功能异常和微量白蛋白尿，随着疾病的进展，肾小球负担加重的患者，容易不可逆转的损害到肾功能，最终发展为终末期肾脏疾病，严重威胁人类健康和生命。目前，在临床治疗中广泛使用的维持性血液透析技术已经提高了慢性肾脏病的存活率〔6〕。但是在DN患者中存在着透析膜和透析液之间的生物不相容，再加上细菌内毒素的直接入侵，导致大量的炎症细胞被激活，从而引起炎症级联扩增反应造成内脏的功能障碍。炎症细胞同时进行的“呼吸爆发”释放出大量的氧自由基，引起机体的氧化应激，最终使体内的氧化和抗氧化失衡，愈发趋于氧化，脂质过氧化损害了肾小球，诱发肾间质水肿，并加重病情〔7〕。

NF-κB为调节基因转录主要因子，在炎症反应起始及发展过程中起关键作用〔8〕。NF-κB的激活途径主要包含经典途径和旁路途径。NF-κB在静息状态下，以p50/p65二聚体形式存在于细胞质中，抑制IκB与两个亚基形成的同源和(或)异源二聚体再进行结合，成为无活性的三聚体。然而发生炎症反应时，IκB被磷酸化、泛素化，阻止NF-κB进入胞核与DNA结合，随后p50/p65被释放并发生核转位，结合于相应靶基因上的κB位点，从而对基因转录起调节作用〔9〕。而非经典NF-κB信号通路是IKKα介导的，当发生肾损伤时，在相关改变的刺激下，NF-κB诱导激酶作用，磷酸化激活细胞内IKKa，形成以p52为特征的信号通路，其在细胞核内与目的基因结合，调控基因表达〔10〕。细胞因子作为炎症反应的重要介质，是DN免疫炎症主要参与者，而NF-κB在这一过程中起信号转导枢纽作用，是机体免疫炎症反应的关键调控者，活性同时受到细胞内和细胞外反馈调节的影响。在刺激作用下，细菌内毒素可通过正反馈调节促使炎症反应信号进一步扩散，激活NF-κB，并使得受到IL-4、IL-10等抑炎细胞因子制约的IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎细胞因子大量转录，而后者亦可反调节NF-κB，使其激活，形成促炎因子的放大效应，生成更多的细胞因子，影响正常机体的Th1/Th2动态平衡〔11〕。本研究结果显示，老年DN维持性血液透析患者存在Th1/Th2失衡，并且失衡向免疫炎症方向漂移，但经复方血栓通胶囊辅助治疗后，患者机体Th1/Th2动态平衡状态得到显著改善，这可能与复方血栓通胶囊通过抑制NF-κB信号通路活化，调节细胞因子的变化有关。

有研究发现〔12〕，氧化应激作用的对象是脂质、核酸、蛋白质，即当内皮细胞、基底膜细胞中内活性氧自由基的生成和消除的动态平衡遭到破坏后，可引起三者过氧化损伤，引起细胞的凋亡。其中PC是蛋白质氨基酸侧链发生氧化反应的产物，8-OHdG是核酸中鸟嘌呤被氧化的产物，脂质过氧化的产物是MDA。本研究结果复方血栓通胶囊辅助治疗可显著抑制氧化应激反应、减少氧化产物的生成并增强抗氧化能力。分析原因可能与复方血栓通胶囊所含的黄芪、丹参均为补血之品，可益气活血、化瘀通络、走而不守，具有引经之效，明显改善多脏器的供血，从而起到抗氧化的作用。

相关实验研究表明〔13〕，作为典型的微血管并发症，血管内皮损伤以及功能障碍在DN的发生发展中有着重要的作用，患者多表现为病灶局部的血管通透性显著增加、血管生成量明显增多。Ang家族是近年来新发现的一种内皮细胞特异性促血管生成因子，包括Ang1和Ang2，均可以通过与受体络氨酸激酶受体(TiE)2结合而参与各种生理和病理性血管生成〔14〕。VEGF也是一种重要的促进患者血管生成的介导因子。它可以加速血管生成并显著促进血管内皮细胞的增殖和血管渗漏作用〔15〕。肾小球局部Ang1、Ang2、VEGF表达增加，会引发血管的细胞外基质沉积，血管内皮细胞增殖能力增强，血管内皮功能完整性破坏，共同损伤机体肾小球滤过功能。本研究对上述血管新生因子水平进行检测后发现，复方血栓通胶囊辅助治疗可有效调节老年DN维持性血液透析患者血清中血管活性分子表达水平，以改善微循环状态，避免进一步损害肾小球滤过功能。其产生有效作用可能是由于，在组成复方血栓通的药物中，包含降低血液黏稠度的三七黄酮，间接减少红细胞聚集率，改善微循环；三七皂苷，能够有效促进肝、肾和血清蛋白质的合成，保护缺血组织中的微血管膜的稳定性。

此外，比较两组方案不良反应发生率发现，治疗组加以复方血栓通胶囊口服，并没有产生更多不良反应，相反还降低了患者因长期血液透析所致的不良反应发生。这可能由于复方血栓通胶囊本身对人体正常细胞的细胞毒性和对组织器官毒性作用均较弱，且能够通过提高患者机体免疫功能以改善因血液透析所引入的毒副作用。但本研究亦存在不足之处，即样本量过小，未施盲法等因素，在后续研究中仍需行大样本、多中心的双盲试验，以更有效地探索对于老年DN维持性血液透析患者来说，复方血栓通胶囊辅助治疗的最终效应。