基于网络药理学和分子对接技术探讨复元活血通脉汤防治冠心病的作用机制

张海涛 乔盼 于智莘 王冰梅

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

冠心病(CHD)是由于冠状动脉粥样硬化或功能性改变导致心肌缺血缺氧而引起的心脏病，又称冠状动脉粥样硬化性心脏病或缺血性心脏病，典型症状包括胸闷、胸痛及呼吸短促，易引发心肌缺血、缺氧、坏死、心力衰竭、心律失常等，如不及时抢救，病死率极高，严重威胁人类的身体健康。目前我国冠心病患者1 100万例，防控形势严峻〔1〕。西药治疗主要使用抗血小板聚集药物和抗心肌缺血药物，但长期使用副作用大，成本高，临床应用受到限制。中药治疗CHD，效果明显，价格适中，患者易接受。

复元活血通脉汤是由补阳还五汤与丹参饮加减化裁而成，由黄芪、党参、桃仁、红花、丹参、水蛭、川芎、枳壳、降香、柴胡、砂仁、山茱萸、桂枝、瓜蒌、甘草组成，有温阳化气、温经通脉、活血化瘀之效。方中以黄芪、党参为君药大补宗气，增强“阳化气”的功能，使气旺以促血行，瘀祛而不伤正。桃仁、红花、丹参、水蛭、川芎为臣药，化瘀通脉，使由于“阴成形”功能失常而导致的瘀血得以消散。枳壳、降香、柴胡、砂仁为佐药，调和中焦脾胃气机，使后天“阳化气、阴成形”的功能正常。山茱萸“敛正气而不敛邪气”，防治活血化瘀药效过猛而导致出血，达到祛瘀而不伤正的目的。桂枝温通经脉，提高黄芪、党参的“阳化气”功能。瓜蒌、甘草为使药，瓜蒌又为引经药，引诸药直达胸部，甘草调和诸药。

该方应用普遍，效果明显，但其具体作用机制尚不清楚。网络药理学基于系统生物学理论，运用数据挖掘技术综合分析中药复方防治疾病的交集靶点，并对交集靶点进行功能富集分析等，尝试阐明中药复方可能的作用机制，为中药复方作用的分子机制提供研究基础〔2〕。本研究基于网络药理学技术，探究复元活血通脉汤防治CHD的作用机制。

1 材料与方法

1.1复元活血通脉汤有效成分的筛选及靶点预测 首先分别检索中医药整合药理学研究平台V2.0(http：//www.tcmip.cn/TCMIP/index.php，TCMIP)、中药系统药理学分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP,http：//tcmspw.com/tcmsp.php)和BATMAN-TCM数据库(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，并结合已发表的中药成分相关文献〔3，4〕，得到复元活血通脉汤中15味中药的有效成分及相关靶点，其中筛选条件〔5〕为口服生物利用度(OB)≥30%，药物类药性(DL)≥0.18。然后采用Perl软件(V5.30.0)将中药活性成分与相应靶点进行一一映射，并为筛选出的靶点添加基因名。

1.2CHD的靶点筛选 以“coronary heart disease”和“coronary disease”为关键词，检索Gene Cards数据库(https：//genealacart.genecards.org/)、OMIM数据库(https：//www.omim.org/)、Pharm Gkb数据库(https：//www.pharmgkb.org/)、TTD数据库(http：//db.idrblab.net/ttd/)和Drug Bank数据库(https：//www.drugbank.ca/)疾病相关靶点，得到疾病相关靶点。

1.3复元活血通脉汤防治CHD的调控网络构建 利用Perl软件将复元活血通脉汤活性成分靶点和CHD疾病靶点进行一一映射，得到中药复方活性成分与疾病的交集靶点，然后利用Cytoscape软件(V3.7.1)进行网络可视化，得到活性成分-交集靶点调控网络。其中节点的类型有活性成分、靶点。

1.4靶点蛋白互作网络(PPI)构建及核心靶点筛选 利用STRING在线软件(https：//string-db.org/)将1.3得到的活性成分与疾病的交集靶点输入软件，筛选条件为种属选择人，最小互作分数值为0.9，保存相应结果文件。将所得文件输入R语言计算，得到蛋白互作网络靶点的条图。见图1。

图1 中药-疾病关键靶点的条图

利用Cytoscape软件(V3.7.1)的插件CytoNCA对PPI网络进行拓扑分析，选取介度中心性(BC)、接近中心性(CC)、度自由性(DC)、特征向量中心性(EC)、局部边连通性(LAC)、网络中心性(NC)等5个指标，其中，同时满足大于5个指标中位数2倍的节点作为关键靶点，以尽可能筛选出关键靶点。

1.5分子对接分析 对复元活血通脉汤自由度排名靠前的有效成分和关键靶点进行分子对接，首先从Pub Chem网站(https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载药物有效成分的2D结构，并利用ChemOffice软件将2D结构转换成3D结构，其次从PDB数据库(http：//www.rcsb.org/)获取关键靶点的3D结构，并利用PyMOL软件对关键靶点的3D结构删除水分子及小分子配体，最后利用autodock vina1.1.2软件完成分子对接分析。

1.6GO功能富集分析 见图2，图3，图4。

图2 生物过程

图3 细胞组分

图4 分子功能

将1.3得到的活性成分与疾病的交集靶点利用R语言软件的Bioconductor生物信息软件包进行处理，得到GO功能富集分析。

1.7KEGG通路富集分析 将1.3得到的活性成分与疾病的交集靶点利用R语言软件的Bioconductor生物信息软件包进行处理，得到KEGG通路富集分析见图5。

图5 KEGG通路富集分析柱

1.8KEGG关系网络构建 将1.3得到的活性成分与疾病的交集靶点和1.6得到的KEGG通路富集分析结果利用Perl 软件进行一一映射，并利用Cytoscape软件进行网络可视化。其中节点的类型有KEGG通路和交集靶点。

2 结 果

2.1复元活血通脉汤活性成分及靶点筛选的结果 分别检索TCMIP数据库、TCMSP数据库和BATMAN-TCM数据库中复元活血通脉汤所有活性成分及相关靶点，并结合已发表的相关文献，对筛选出的靶点添加基因名。根据OB和DL参数对复元活血通脉汤的活性成分进行筛选，分别得到甘草活性成分92个、丹参活性成分65个、降香活性成分37个、桃仁活性成分23个、红花活性成分22个、党参活性成分21个、山茱萸活性成分20个、黄芪活性成分20个、柴胡活性成分17个、瓜蒌活性成分11个、砂仁活性成分10个、川芎活性成分7个、桂枝活性成分7个、枳壳活性成分5个、水蛭活性成分1个。对所有活性成分相应的靶点添加基因名后，共得到活性成分的靶点基因3 927个，其中甘草靶点基因1 531个、丹参靶点基因825个、降香靶点基因521个、黄芪靶点基因405个、党参靶点基因193个、山茱萸靶点基因108个、枳壳靶点基因103个、桃仁靶点基因102个、砂仁靶点基因63个、川芎靶点基因39个、瓜蒌靶点基因31个、水蛭靶点基因3个、红花靶点基因2个、柴胡靶点基因1个。

2.2CHD的靶点筛选结果 以“coronary heart disease”和“coronary disease”为关键词，分别检索Gene Cards数据库、 OMIM数据库、Pharm Gkb数据库、TTD数据库和Drug Bank数据库，取并集后得到疾病相关靶点2 180个。

2.3复元活血通脉汤防治CHD的的调控网络构建 利用Perl软件将复元活血通脉汤活性成分靶点3 927个和CHD疾病靶点2 180个取交集后得到211个交集靶点，这211个交集靶点对应复元活血通脉汤中236个活性成分。甘草活性成分76个、丹参活性成分55个、降香活性成分25个、桃仁活性成分16个、砂仁活性成分4个、柴胡活性成分1个、川芎活性成分2个、党参活性成分9个、瓜蒌活性成分6个、黄芪活性成分6个、山茱萸活性成分6个、水蛭活性成分1个、枳壳活性成分3个、多味药共有活性成分26个。

2.4PPI的构建及核心靶点筛选 PPI网络使基因、蛋白之间相互作用关系可视化，为筛选中药复方调控疾病发生的关键靶点提供了可能。据图1可知，中药-疾病核心基因按邻接节点数目由多到少依次为：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1，又称蛋白激酶B(AKT1或PKB)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)1、MAPK3、信号传导及转录激活因子(STAT)3、JUN、热休克蛋白(HSP)90AA1、APP、MAPK14、MAPK8、RELA、表皮生长因子受体(EGFR)、雌激素受体α(ESR1)、FOS、白细胞介素(IL)6、蛋白激酶Cα(PRKCA)、视网膜母细胞瘤基因(RB)1、血管内皮生长因子 (VEGF)A、表皮细胞生长因子(EGF)、糖皮质激素受体基因(NR3C1)、类视黄醇X受体α(RXRA)、CCND1、CDKN1A、蛋白激酶Cβ(PRKCB)、MYC、核受体辅激活蛋白(NCOA)1、胱天蛋白酶(CASP)8、胱天蛋白酶(CASP)3、STAT1、BCL2、CREB1。邻接节点数目越多，成为核心基因的概率越大。BC、CC、DC、EC、LAC、NC等大于2倍中位数的关键靶点有CCND1、MAPK8、JUN、MAPK14、AKT1、MAPK3、MYC、MAPK1、TP53、RELA、STAT3。这11个关键靶点是复元活血通脉汤防治CHD的核心作用靶点，有重要研究价值。见图6。

图6 中药-疾病关键靶点筛选策略

2.5分子对接结果 为了进一步验证网络预测能力，本研究应用分子对接技术探讨复元活血通脉汤防治CHD的作用机制。在复元活血通脉汤-CHD-靶点调控网络中选取自由度较高的槲皮素、山奈酚、木犀草素、丹参酮ⅡA作为候选对接药效成分；选取关键靶点中的AKT1、JUN、STAT3作为候选对接靶点，进行分子对接。成分与靶点的结合能及形成氢键数量是评价分子对接结果的重要依据。结合能越低，氢键数量越多，结合就越稳定，靶点与分子作用的可能性就越大。从分子对接结果可知，槲皮素、山奈酚、木犀草素、丹参酮ⅡA与3个靶点的结合能均较低，且能形成氢键，表明复元活血通脉汤可有效防治CHD。见图7，表1。

图7 核心成分与靶点对接示意图

表1 复元活血通脉汤核心成分与靶点的结合情况

2.6GO功能富集分析 GO功能富集分析主要包括生物过程(BP，图2)、细胞组分(CC，图3)、分子功能(MF，图4)三部分。通过R语言软件的Bioconductor生物信息软件包进行GO功能富集分析后，富集比较明显的前10个生物过程包括：对金属离子的反应、对营养水平的反应、对抗生素的反应、对类固醇激素的反应、对活性氧的反应、氧化应激反应、对脂多糖的反应、对氧含量的反应、对细菌来源分子的反应、对外源刺激的反应。富集比较明显的前10个细胞组分包括：膜筏、膜微区、膜区、受体复合体、突触后膜的组成成分、突触后膜的内在成分、突触膜的固有成分、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物、突触膜的内在成分、突触前膜的固有成分。富集比较明显的前10个分子功能包括：核受体活性、转录因子活性(直接配体调节的序列特异性DNA结合)、类固醇激素受体、肾上腺素能受体活性、G-蛋白耦联胺受体活性、儿茶酚胺结合、辅因子结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、磷酸酶结合、转录因子活性(RNA聚合酶Ⅱ近端启动子序列特异性DNA结合)。

2.7KEGG通路富集分析 通过R语言软件的Bioconductor生物信息软件包进行KEGG通路富集分析后，富集比较明显的前20个通路包括：糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、前列腺癌、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、胰腺癌、TNF信号通路、IL-17信号通路、丙型肝炎、人巨细胞病毒感染、内分泌抵抗、膀胱癌、非小细胞肺癌、Th17细胞分化、细胞凋亡、弓形虫病、小细胞肺癌、PI3K-Akt信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、麻疹。见图5。

2.8KEGG关系网络构建 106个交集基因可通过调节20个通路来影响CHD的发生。其中与信号通路相关的有糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、TNF信号通路、IL-17信号通路、Th17细胞分化和PI3K-Akt信号通路；与癌症相关的有前列腺癌、胰腺癌、膀胱癌、非小细胞肺癌和小细胞肺癌；与病毒相关的有卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染和麻疹；与肝炎相关的有乙型肝炎、丙型肝炎。

3 讨 论

CHD由于年老体衰、正气亏虚、脏腑功能损伤、阴阳气血失调、导致气滞血瘀、胸阳不振、痰浊内生、心脉痹阻而发病。其中心、肝、脾、肺、肾五脏虚损是病之本，气滞、血瘀、痰浊、寒凝是病之标，本虚标实是CHD病机特点。本方温阳化气、温经通脉、活血化瘀。中药复方所含成分复杂，药理作用广泛，本研究基于网络药理学技术研究复元活血通脉汤防治CHD的作用机制，筛选中药复方主要活性成分及交集基因，并对交集基因进行功能富集分析，表明中药复方可通过多成分、多靶点、多通路影响CHD发生。

本研究通过构建中药复方-疾病-靶点调控网络，发现复元活血通脉汤中236个活性成分通过调控211个交集靶点影响CHD的发生。这236个活性成分按 “度自由性”值排列前十的分别是：槲皮素、山奈酚、木犀草素、丹参酮ⅡA、7-O-甲基异戊烯醇、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、柚皮素、(-)-前庭醇、隐丹参酮、新龙果碱。槲皮素对CHD有扩张冠状动脉、增加冠状动脉血流量和降血脂等作用，已被制成多种成药广泛使用〔6〕。槲皮素可通过提高胆固醇逆转运途中相关转运蛋白ABCA1和ABCG1的表达，下降血清IL-6、TNF-α水平，从而改善胆固醇的逆转运功能和巨噬细胞内的炎症反应，防治CHD〔7〕。山奈酚可通过抑制氧化应激和炎症反应，防治动脉粥样硬化，还可通过沉默调节因子(SIRT)1 介导的线粒体途径，显著增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，抑制心肌细胞的凋亡〔8〕。木犀草素、山奈酚可通过抗脂代谢紊乱和抗细胞凋亡，保护大鼠离体心肌缺血/再灌注损伤〔9〕，其作用机制可能与提高心肌细胞中线粒体延长因子(MIEF)1表达有关〔10〕。丹参酮ⅡA磺酸钠可通过保护心肌缺血再灌注损伤，降低心肌梗死面积，改善冠状动脉循坏，明显提高CHD患者的左室舒张末径(LVEDD)、心输出量(CO)和左室射血分数(LVEF)等心功能指标〔11〕。柚皮素可通过抑制PI3K信号通路和升高血小板内cGMP水平等，抗血小板聚集和动脉血栓形成，防治CHD〔12〕。以上研究表明，槲皮素、山奈酚、木犀草素、丹参酮ⅡA、柚皮素，能够通过多通路防治CHD的发生，而复元活血通脉汤中这5种成分含量多，靶点多，是防治CHD的重要候选化合物。

本研究通过构建PPI网络并进行核心靶点筛选，共筛选出30个核心靶点，前15个靶点(邻接节点数大于20)分别是AKT1、MAPK1、MAPK3、STAT3、JUN、HSP90AA1、APP、MAPK14、MAPK8、RELA、EGFR、ESR1、FOS、IL-6、PRKCA。其中，AKT1〔13〕、MAPK1〔14〕、STAT3〔15〕、JUN〔16，17〕、ESR1〔18〕、FOS〔19〕、IL-6〔20〕、PRKCA〔14〕等已被实验证实参与了CHD的病理过程，这些靶点可能也是复元活血通脉汤防治CHD的关键靶点。

GO功能富集分析表明复元活血通脉汤可能通过核受体活性、转录因子活性、肾上腺素能受体活性、G-蛋白耦联胺受体活性、儿茶酚胺结合、辅因子结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、磷酸酶结合等防治CHD。KEGG通路富集分析表明复元活血通脉汤可能通过糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、前列腺癌、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、胰腺癌、TNF信号通路、IL-17信号通路、丙型肝炎、人巨细胞病毒感染、内分泌抵抗、膀胱癌、非小细胞肺癌、Th17细胞分化、细胞凋亡、弓形虫病、小细胞肺癌、PI3K-Akt信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药性、麻疹等通路防治CHD。其中，实验研究表明AGE-RAGE信号通路〔21〕、前列腺癌〔22〕、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎〔23〕、TNF信号通路〔24〕、IL-17信号通路〔25〕、丙型肝炎〔26〕、人巨细胞病毒感染〔27〕、内分泌抵抗〔28〕、Th17细胞分化〔29〕、细胞凋亡〔30，31〕、PI3K-Akt信号通路〔30，31〕等参与CHD的发病。

综上，复元活血通脉汤中的主要活性成分槲皮素、山奈酚、木犀草素、丹参酮ⅡA、柚皮素通过影响AKT1、MAPK1、STAT3、JUN、ESR1、FOS、IL-6、PRKCA等靶点，进一步调控AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、TNF信号通路、IL-17信号通路、PI3K-Akt信号通路等，防治CHD的发病。