防控烟草青枯病植物免疫诱抗剂的筛选及其防治效果测定

薛 梅，曾婉琳，张 荣,2，冯淑杰,2

（1.华南农业大学园艺学院，广东 广州 510642；2.华南农业大学广东省群体微生物研究中心，广东 广州 510642）

【研究意义】青枯病是由青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一种土传病害，是世界范围内最重要的植物毁灭性病害之一［1-2］。烟草是我国重要的经济作物，烟株一旦被青枯病感染，将会严重影响烟叶的产质量，甚至造成整株死亡，对烟草带来毁灭性的损失［1,3-5］。由于青枯病侵染烟草造成的损失居各类烟草侵染性病害第4 位［6］，该病害已成为制约烟草安全健康发展的重要障碍。因此，寻求有效的烟草青枯病防治措施一直受到研究者的关注［7］。而在目前我国大力提倡农药减施的前提下，探索有效且对环境安全友好的青枯病防控措施显得尤为必要。

【前人研究进展】植物的诱导免疫抗性，是指充分利用植物自身对病害发生的潜在控制能力，通过调节植物防卫、代谢系统，诱导产生基础免疫反应，延迟或减轻病害发生和发展的一种特性［8］。植物免疫诱抗剂，也叫植物疫苗，利用诱导因子激发出植物这种潜在的对病害的抗病性，如苯丙氨酸解氨酶（PAL）、β-1,3-葡聚糖酶、过氧化物酶（POD）等的反应、病程相关蛋白（PR）的调控与表达以及抗病物质的变化，从而防控植物病害的发生［9］。因此植物免疫诱抗剂是生物防治中一类新型的环保型植物保护剂，符合我国发展绿色农业的要求［10-15］。近年来，在烟草青枯病防治上也对植物免疫诱抗剂的应用进行了探索。陈泽鹏等［16］研究发现诱抗剂苯并噻二唑（BTH）对烟草诱导抗病具有显著效应，抗病效率为52.76%。王志愿［17］研究发现诱抗剂壳聚糖（CTS）对烟草青枯病的防控效果达81.17%。蒋承耿等［18］研究发现0.136%赤·吲乙·芸薹可湿性粉剂10 000 倍液处理对烟草青枯病的诱抗效果可达78.02%。韩松庭等［19］将2,6-二氯异烟酸与多粘类芽孢杆菌联用，发现其对青枯病的防控效果显著高于其他处理。

【本研究切入点】目前烟草青枯病的防治主要包括抗病性品种的种植、农业防治措施、生物防治措施、化学防治措施、综合防治措施以及利用土壤添加剂防治等一系列方式［7,20］，但在很大程度上仍倾向于化学防治。而化学药剂不仅易使青枯病菌产生耐药性，对土壤和水体等都有严重危害，而农业防治操作困难，在防治方式选择上只能作为辅助措施。因此，具有无污染、不易产生抗性、对人畜安全等优点的生物防治成为防治青枯病的研究热点［6,21-22］。植物免疫诱抗剂具有预防性、系统性、稳定性、相对性、安全性等一系列优点，利用植物天然免疫系统防治病虫害，从源头上减少农药对环境和农产品的污染，更符合当今农业可持续发展的要求。【拟解决的关键问题】本研究对不同来源的植物免疫诱抗剂智能聪、阿泰灵、氨基寡糖素，以及纳米材料NANO ZnO 进行平板抑菌测定和盆栽试验，选择出对烟草青枯病有显著防治效果的诱抗剂，以达到烟草病害防治中减药的目的，为烟草青枯病的绿色防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

烟草青枯病菌（R.solanacearum）菌株203，为广东省烟草产区分离的强致病力菌株；供试烟草品种为普通烟草（Nicotiana tabacumL.）K-326，为目前广东烟叶生产中的主栽品种，对青枯病菌抗性表现为中抗。

智能聪（1 mg/g，粉剂），由山东蓬勃生物科技有限公司提供；阿泰灵（6%寡糖·链蛋白可湿性粉剂），购自中国农业科学院植物保护研究所廊坊农药中试厂；0.5%氨基寡糖素水剂，购自成都新朝阳作物科学有限公司；纳米材料NANO ZnO，由华南农业大学园艺学院黄雪梅副教授提供；90%农用链霉素购自郑州联农瑞丰德科技有限公司；分析纯链霉素购自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 不同植物免疫诱抗剂对烟草青枯菌的平板抑制作用 采用抑菌圈法进行平板抑制试验。吸取2 mL 预先备好的青枯菌液（OD600=0.1）加入30 mL 的NA 培养基中，混匀倒平板。凝固后用打孔器将每个皿培养基打出呈三角形分布的3 个孔。每孔注入20 µL 不同浓度的供试药剂。30 ℃培养48 h，根据十字交叉法测量抑菌圈大小。以不加药剂为空白对照，以不同浓度链霉素处理为阳性对照，每个处理3 次重复。试验重复2 次。各植物诱抗剂浓度设置见表1。

表1 抑菌圈法中各植物免疫诱抗剂供试浓度Table 1 Test concentration of each plant immune inducers in the inhibition method

1.2.2 不同植物免疫诱抗剂最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）的测定 为进一步了解供试药剂的抑菌作用，对其进行MIC、MBC 测定。根据抑菌试验结果，设置供试药剂的3 个初始浓度：智能聪10、5、2.5 µg/mL，阿泰灵6、3、1.5 µg/mL，氨基寡糖素2 000、1 000、500 µg/mL，阳性对照链霉素6.675、3.3375、1.66875 µg/mL。

然后将1 mL OD600=0.3～0.4 的青枯菌液和药剂混合，加入NB 培养基至20 mL。30 ℃、180 r/min 振荡培养12 h，菌液透明澄清时所对应的药液浓度即为MIC。MBC 根据MIC 的测定结果，选取1MIC、2MIC 和4MIC 对应样品的菌液，吸取20 µL 在NA 平板上涂布，30 ℃培养12 h，无菌落生长的最低药物浓度即为MBC。试验重复2 次。

1.2.3 不同植物免疫诱抗剂防治烟草青枯病的盆栽试验 将0.1 µg/mL 智能聪、3 µg/mL 氨基寡糖素、150 µg/mL 纳米和8 µg/mL 阿泰灵的水溶液分别与灭菌后的田园土、基质均匀，培育烟草苗，移栽后15 d 浇灌相应诱抗剂20 mL，每个处理3 次重复，每个重复10 株，对照浇清水。移栽后40 d 采用灌根法［23］接种20 mL/株的OD600=0.3～0.4 的青枯菌液，放置于30 ℃条件下，8 h/12 h 光暗交替处理，定期观察发病情况，统计病情指数，并计算防治效果。试验重复3 次。

病害调查参照国家烟草专卖局发布的烟草病害分级及调查方法（YC/T）39-1996 进行。烟草青枯病病按5 级分级标准调查病害严重度：0 级：全株无病；1 级：茎部偶有褪绿斑，或在有条斑一侧有少数叶片凋萎；2 级：茎部有黑色条斑，但尚未达到顶部，或病侧半数以上叶片凋萎；3 级：茎部黑色条斑到达植株顶部，或病侧2/3 以上叶片凋萎；4 级：病株基本枯死。

试验数据采用SPSS（21.0）进行单因素方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同植物免疫诱抗剂对烟草青枯菌的平板抑菌测定

4 种供试诱抗剂和阳性对照链霉素对烟草青枯菌生长表现了不同的抑制效果。其中，高浓度的氨基寡糖素和纳米材料及阳性对照链霉素表现了直接的抑菌效果，而不同浓度的智能聪和阿泰灵均没有显示对青枯病菌的抑制作用。抑制效果最明显的为5 000 µg/mL 氨基寡糖素水剂，抑菌圈半径高达35.2 mm（图1A1），其次是8 000 µg/mL 的纳米材料，抑菌圈半径为20.5 mm（图1B1）；随着供试浓度的降低，氨基寡糖素和纳米材料抑菌效果明显降低，50 µg/mL 氨基寡糖素基本不会产生抑菌圈（图1A3），而80 µg/mL 纳米材料仅有5.8 mm 的微弱抑菌圈；阳性对照链霉素的抑菌效果在测试范围内都较为稳定。

图1 氨基寡糖素水剂、纳米材料、链霉素对烟草青枯菌的平板抑菌试验Fig.1 Plate antibacterial experiment of amino- oligosaccharin,NANO ZnO and streptomycin against Ralstonia solanacearum

2.2 不同植物免疫诱抗剂最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定

在供试药剂中，氨基寡糖素和链霉素对烟草青枯菌表现了较强抑菌效果。其中氨基寡糖素的MIC值为10 000 µg/mL，MBC值为20 000 µg/mL；链霉素的MIC值为6.675 µg/mL，MBC值为13.35 µg/mL。而在有效供试浓度内，智能聪、阿泰灵各浓度对应的菌液变浑浊，均没有测到MIC。进一步说明这2种药剂对烟草青枯病菌没有直接的抑菌作用。

2.3 不同植物免疫诱抗剂防治烟草青枯病的盆栽试验

盆栽防治试验结果（表2）显示，智能聪、阿泰灵和氨基寡糖素对烟草青枯病的发生均具有一定的防治效果，在整个发病过程中，各处理病情指数始终低于对照。其中，诱抗剂智能聪对烟草青枯病的防治效果最好，且可以延缓病害的发生1～2 d，其防治效果始终优于链霉素处理。如接种后10 d，智能聪防效为57%，显著优于链霉素处理的37%防效，而阿泰灵、氨基寡糖素对烟草青枯病的防治效果较差，防效仅为15%、13%；纳米NANO ZnO 的防治效果最差，在病害发生早期，病情指数与对照无显著差异。

表2 不同药剂处理对烟草青枯病发生的防治效果Table 2 Control effect of different agent treatments on tobacco bacterial wilt

3 讨论

植物免疫诱抗剂作为一种新型的生物防治制剂，不仅能有效防治病虫害，还能提高作物产量，对植物的抗逆功能也有提高作用［24］，因此在烟草病害的综合防治中越来越受到重视［25］。智能聪是从野生沙刺内生菌宛氏拟青霉菌（Paecilomyces variotii）中提取的一种高效环保的新型免疫诱抗剂，具有促进植物生长、提升抗病等抗逆能力、增加产量等作用［26］。郭梅燕等［27］报道了智能聪对烟草病毒病表现出良好防效，且可以减轻根茎类病害和后期叶斑类病害的发生程度，其中以500 ng/mL 智能聪抗病毒病、赤星病等病害的效果最好，抗病毒效果可达57.07%。本研究中，不同浓度植物诱抗剂智能聪对烟草青枯病菌没有显示直接的抑菌作用，而在盆栽试验中0.1 µg/mL 智能聪能够延缓烟草青枯病的发生，且对烟草青枯病起到较好的防治作用，其防治效果高于链霉素。这可能是因为智能聪预处理烟草苗后，在接种青枯菌之前激活了烟草自身的免疫代谢系统，不仅诱导相关防御酶活性的提高，还激活抗病相关基因的上调表达，生理和分子同时调控烟株的抗性，使烟株获得抵御病害的能力［26,28］。因此，智能聪可作为取代或部分取代烟草青枯病防治所需化学药剂的参考药剂。

氨基寡糖素也称为农业专业壳寡糖，是从海洋生物外壳提取而来的多糖类天然产物［29］。很多研究表明，氨基寡糖素对烟草普通花叶病毒病的抑制效果明显。苏小记等［30］研究报道2.0% 氨基寡糖素水剂连续喷施3～4 次对烟草病毒病的防效达到72.4%～77.9%。罗刚等［31］发现氨基寡糖素和钾营养调节剂（肥万钾）配施能有效降低烟株普通花叶病毒病的发病率和病情指数，并以两次防治后的降幅最大，防治效果明显，两点的平均防效达到56.31%，大大减轻了普通花叶病对烟叶生产的危害。目前关于氨基寡糖素对烟草青枯病作用效果的报道仍然较少。本研究在平板对峙试验中，高浓度的氨基寡糖素对烟草青枯病菌有显著抑制作用，而该浓度远高于其大田使用浓度，参考意义不大；在盆栽防效试验中，其对烟草青枯病的防治效果较差。

阿泰灵是世界上首个研制出来的植物免疫蛋白质的生物农药，为3%氨基寡糖素和3%极细链格孢激活蛋白组成的复合制剂，充分利用了两种成分的相互增效作用，诱导作物多重反应，调节土壤微生物区系，改善作物品质，刺激作物生长，达到作物增产增收的效果［9］。然而，本研究的平板测定和盆栽试验中，阿泰灵均没有显示出抑菌和良好的防病效果，但明显地促进植物生长（数据未列出）；而NANO ZnO 则表现为高浓度时对烟草青枯病菌有一定的抑制作用（但此浓度并不适合用于植物处理），而在盆栽防效试验中，其对烟草青枯病几乎没有防治效果，但明显地促进植物生长（数据未列出）。这也进一步说明不同诱抗剂诱导植物产生抗病性的机理并不相同，不同的处理时期、处理方法或处理浓度可能都会存在差异。因此，想要挖掘更多、更有效的诱抗剂，尚需更多的试验去完善，也需要进一步对其诱导植物抗性产生的分子机理进行探索。

4 结论

烟草青枯病属于细菌性土传病害，寄主范围广，防治困难，烟株一旦被侵染，极易造成毁灭性损失，严重影响烟业的产质量。本试验通过平板对峙联合盆栽防效试验筛选到对烟草青枯病有显著防控作用的一种植物免疫诱抗剂智能聪。在育苗前利用适宜浓度智能聪拌种，待移栽成活后采用灌根法浇灌智能聪于烟株根部，可诱导烟株产生抗性，延缓病害发生，在接种青枯病菌后10 d 对烟草青枯病的防治效果可达57%，优于链霉素处理，因此可用于烟草青枯病的绿色防控，并在一定程度上可作为取代或部分取代化学药剂的参考药剂进行使用。