食管鳞状细胞癌组织中LncRNA linc00342的表达及临床意义

尚庆毅,梁伟

(1.赣榆区人民医院检验科,江苏连云港 222100；2.连云港市第二人民医院医学检验科,江苏连云港 222023)

食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是一种来源于食管鳞状上皮黏膜细胞的恶性肿瘤，具有高侵袭性[1]。ESCC的转移及复发是导致患者病死率升高的最主要原因[2]，深入研究ESCC的发病机制及分子作用机制，对ESCC的早期诊断及预后判断具有重要的临床意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类长度超过200个核苷酸、无编码能力的RNA分子，在调控机体表观遗传、转录后加工等过程中发挥重要作用，近年来，LncRNA在肿瘤进展过程中的作用备受关注[3]。目前研究发现，LncRNA linc00342在多种恶性肿瘤中表达上调，并可通过激活信号通路或分子机制参与肿瘤的发生、发展[4-5]。然而LncRNA linc00342在ESCC中的表达情况目前尚不清楚。因此，本研究通过检测ESCC患者组织中LncRNA linc00342的表达水平，分析其与患者临床病理参数及预后的关系，初步讨论其临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2015年6月至2016年9月于赣榆区人民医院接受ESCC根治术的89例ESCC患者癌组织及对应的癌旁食管鳞状上皮黏膜组织(距离癌组织>5 cm，且经病理组织学证实无癌细胞)标本为研究对象，术中获取标本立即置入液氮中保存。所有患者均经消化内镜活检或病理组织检查确诊，术前未接受任何放疗、化疗或抗肿瘤药物等治疗。排除合并其他恶性肿瘤或伴发器质性损伤疾病或系统性疾病，如高血压、糖尿病、慢性肾病等。89例ESCC患者中男51例，女38例，年龄46～82岁，中位年龄64岁，其中年龄<64岁43例，≥64岁46例；肿瘤位置：胸上段34例，胸中段29例，胸下段26例；分化程度：中分化或高分化49例，低分化或未分化40例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期36例，Ⅲ～Ⅳ期53例；发生淋巴结转移47例，淋巴结无转移42例。同时收集患者随访资料，随访截止日期为2020年9月30日，随访时间8～59个月，中位随访时间28个月，分析ESCC患者总生存时间。本研究获得赣榆区人民医院医学伦理委员会批准(批准文号：No.150024)，患者及家属均知情同意。

1.2主要仪器及试剂 Trizol裂解液、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒(日本TaKaRa公司)，逆转录试剂盒(美国Applied Biosystem公司)。7500 Real-Time PCR系统 (美国ABI公司)，UV 240紫外可见分分光度计(日本岛津公司),Bio-Rad PCR扩增仪(美国伯乐公司)。

1.3方法

1.3.1RNA提取及逆转录反应 取手术切除的组织样本，加入2 mL Trizol裂解液后在冰面上研磨，充分研磨成匀浆，提取组织中的总RNA，利用UV 240紫外可见分光度计检测总RNA纯度和浓度，以吸光度(A260/280 nm)值在1.8～2.2之间为纯度较好。提取的DNA置于-80 ℃保存。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。以上操作均按照试剂盒说明书进行。

1.3.2引物设计及qRT-PCR LncRNA linc00342及GAPDH引物序列参照文献[6]设计，linc00342上游引物序列：5′-CGTTCCAATGTGTTGGGT-3′，下游引物序列：5′-TGGGAGGAGGTTGAGATG-3′；GAPDH上游引物序列：5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游引物序列：5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。采用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ试剂盒及ABI 7500 Real-Time PCR系统进行qRT-PCR反应。qRT-PCR总反应体系共20 μL，包括SYBR Green qPCR Mix 10 μL，cDNA 2 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，ddH2O 6 μL。PCR循环参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 45 s，60 ℃ 34 s，共40个循环；72 ℃延伸10 min。采用2-△△Ct法计算LncRNA linc00342相对表达水平。

1.4统计学分析 采用SPSS 25.0统计软件进行数据的录入与分析。计数资料以n或%表示，生存分析采用Kaplan-Meier法，组间生存差异采用对数秩检验(Log-Rank test)；利用ROC曲线评估LncRNA linc00342的表达水平对ESCC患者的预测价值。多因素Cox回归分析影响ESCC患者预后不良的危险因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1LncRNA linc00342在ESCC患者组织中的表达量 ESCC患者癌组织和癌旁组织中LncRNA linc00342的相对表达量分别为3.16±1.27、1.64±0.51，两组间差异有统计学意义(t=10.478，P<0.001)。

2.2LncRNA linc00342表达与ESCC患者临床病理参数的关系 LncRNA linc00342的表达水平与ESCC患者年龄、性别、肿瘤位置、分化程度无关(P>0.05)，而与TNM分期、淋巴结转移有关(P<0.05)。见表1。

表1 LncRNA linc00342表达与ESCC患者临床病理参数的关系

2.3LncRNA linc00342预测ESCC的ROC曲线分析 以LncRNA linc00342的表达水平预测ESCC的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.903(95%CI：0.874～0.938，P<0.001)，当cut-off值为2.33时，其敏感性为80.90%，特异性为89.13%，约登指数为0.730。见图1。

图1 LncRNA linc00342预测ESCC的ROC曲线

2.4LncRNA linc00342表达与ESCC患者生存时间的关系 根据ESCC组织中LncRNA linc00342表达水平的中位数(3.03)将ESCC患者分为高表达组(46例)和低表达组(43例)，生存分析结果显示，LncRNA linc00342高表达患者累积生存率为21.74%，平均生存时间25.5个月(95%CI：20.247～30.753)；LncRNA linc00342低表达患者累积生存率为55.81%，平均生存时间44.86个月(95%CI：39.83～49.89)，两组间差异有统计学意义(Log-rankχ2=20.896，P=0.000)。见图2。

图2 LncRNA linc00342表达水平与ESCC患者生存时间的关系

2.5影响ESCC患者预后不良的单因素分析 单因素分析结果显示，TNM分期、淋巴结转移及LncRNA linc00342表达水平是影响ESCC患者预后不良的危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 影响ESCC患者预后不良的单因素分析[n(%)]

2.6影响ESCC患者预后不良的多因素Cox回归分析 多因素Cox回归分析结果显示，临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移、LncRNA linc00342高表达是影响ESCC患者预后不良的独立预测因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响ESCC患者预后不良的多因素Cox回归分析

3 讨论

近年来，LncRNA在ESCC中的作用越来越受到重视。研究表明，多种LncRNAs在ESCC组织中呈异常表达，可参与癌症的转移侵袭，并可能成为潜在的治疗靶标[7]。杨毅等[8]利用基因芯片技术检测发现，LncRNA linc00152在ESCC组织中的表达显著上调，其表达量与淋巴结转移有关，并对ESCC转移具有较高诊断价值，提示LncRNA linc00152可能是ESCC转移及预后判断的新的生物学指标。

本研究结果显示，LncRNA linc00342在ESCC患者癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织，表明LncRNA linc00342在ESCC组织中呈高表达，可能发挥癌基因作用。另有研究发现[9]，在非小细胞肺癌(NSCLC)患者组织和血清中LncRNA linc00342表达上调，其高表达与较差的总生存期相关，并进一步证实其可通过PTEN和p53通路富集，促进肿瘤细胞增殖，发挥癌基因作用。近年来，LncRNA linc00342在消化道肿瘤中的作用逐渐受到人们关注。曾伟等[10]利用基因芯片重注释发现LncRNA linc00342与肝细胞癌术后复发显著相关，并利用基因共表达网络与功能富集分析发现LncRNA linc00342主要富集到“细胞周期”相关生物学功能与通路，提示LncRNA linc00342可能参与消化道肿瘤细胞周期紊乱而导致的恶性增殖。结合ESCC患者临床病理资料推测，LncRNA linc00342可能由于ESCC细胞周期紊乱而发生异常表达，并与TNM分期及淋巴结转移有关。

本研究利用ESCC组织中LncRNA linc00342的表达水平预测ESCC的ROC曲线下面积为0.903，提示LncRNA linc00342对ESCC具有较高的预测价值，由于本研究纳入的病例数较少，仍需更大样本量进行验证。此外，生存分析结果显示，LncRNA linc00342高表达患者的5年累积生存率明显低于低表达患者。进一步行单因素分析和Cox回归分析显示，TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移及LncRNA linc00342高表达是影响ESCC患者预后不良的独立危险因素，提示LncRNA linc00342可能作为预测ESCC患者预后的潜在生物学指标。

综上所述，ESCC组织中LncRNA linc00342呈高表达，其表达水平与肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关，LncRNA linc00342表达水平升高提示ESCC患者预后不良风险增加，可能作为预测ESCC淋巴结转移及预后不良的潜在生物学指标，但其中具体的作用机制有待进一步研究。