日本鲺(Argulus japonicus)寄生大口黑鲈的首次报道及分子系统发育研究

杨浩，顾泽茂

华中农业大学水产学院/湖北省水生动物病害防控工程技术研究中心,武汉 430070

鲺(Argulus)是一类世界分布的甲壳动物寄生虫，可感染多种淡水鱼类，引发鲺病，造成宿主的大量死亡[1-2]。目前，鲺属内已报道的物种有129个[3]。其中，日本鲺(ArgulusjaponicusThiele 1900)是最常见的种类之一，最早由Thiele在日本发现并命名，之后随着渔业贸易的全球化，在世界各流域均有发现和报道[4-5]。日本鲺在我国分布的首次记载是在1939年[6]，遗憾的是该研究未对宿主进行说明。之后，王耕南[7]、黄琪琰等[8]分别在显微和亚显微水平上详细描述了日本鲺的形态学特征。2014年，Alsarakibi等[9]调查了广东地区青鱼、鲢、虹鳟和鳜等日本鲺的寄生情况，发现在8种淡水鱼上均存在寄生和感染，且池塘养殖条件下日本鲺的感染率和感染强度显著高于野生环境，提出在水产养殖过程中应尤其重视日本鲺病。

大口黑鲈(Micropterussalmoides)，俗称加州鲈，隶属于鲈形目(Perciformes)、太阳鱼科(Centrachidae)、黑鲈属(Micropterus)，原产于北美洲的密西西比河流域，20世纪80年代引入我国[10]。近年来，大口黑鲈已成为我国重要的特色淡水养殖品种之一。然而，随着养殖规模的扩大、集约化程度的提高，大口黑鲈病害频发，严重限制了其养殖产业的发展。2020年5月，湖北省武汉市某养殖场的大口黑鲈发生了一种鲺病，并造成大口黑鲈大量死亡。本文采用形态学和分子生物学的方法，研究了鲺的种类和系统发育关系，将其鉴定为日本鲺，这是日本鲺寄生大口黑鲈的首次报道。

1 材料与方法

1.1 病鱼采集与寄生虫分离

2020年5月，湖北省武汉市某养殖场的大口黑鲈发病，取4尾病鱼(全长30～40 cm，体质量750～850 g)，肉眼观察并记录病鱼体表症状，吸管吸取少量蒸馏水浸湿病鱼体表，用镊子轻轻夹取体表寄生虫转移至装有蒸馏水的培养皿中，用于后续形态学和分子生物学鉴定。

1.2 寄生虫形态学观察

挑选形态完整的虫体于1.5 mL的离心管中，加入4%多聚甲醛于-4 ℃固定24 h。用镊子将固定好的虫体转移到干净的载玻片上，使用Olympus BX53显微镜和Olympus DP72数码成像系统从低倍镜到高倍镜依次观察并记录虫体的形态特征。

1.3 基因组DNA提取，SSU rDNA扩增、测序及系统发育分析

1)基因组总DNA提取。将本文“1.1”中的虫体收集到1.5 mL的离心管中，滴加95%的乙醇于-4 ℃下固定24 h。取出虫体置于新的1.5 mL的EP中，待乙醇挥发后，用基因组提取试剂盒(康为世纪，北京)提取虫体基因组总DNA，保存于-20 ℃备用。

2)PCR扩增SSU rDNA基因序列。选用SSU rDNA通用引物，上游引物：5′-AACCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′，下游引物：5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′[11]，以材料与方法“1.3 1)”中提取的总DNA为模板，进行PCR扩增。50 μL的PCR反应体系包括：2 × EsTaqMasterMix(25 μL)、游引物(2 μL)、下游引物(2 μL)、模板DNA(2 μL)、ddH2O(19 μL)。PCR扩增条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃终延伸10 min。

3)基因克隆与测序。对本文“1.3 2)”中PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(Omega，美国)纯化回收PCR产物，将纯化后的PCR产物连接至pMDTM-19T载体中，转化至感受态细胞DH5α，接于含有Amp的LB固体培养基中，37 ℃培养12 h后挑取单克隆于LB液体培养基中震荡培养5 h，经PCR验证后，将阳性菌株送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序。

4)序列比对与分析。将测序结果进行Blast比对，下载BLASTn相似序列以及鲺属中已收录的小亚基核糖体序列。经MAFFT(v7.273)[12]软件比对后，使用G-blocks(v0.91b)[13]删除模糊比对片段，利用IQ-TREE (v1.6.12)[14]软件构建ML系统进化树。

2 结果与分析

2.1 患病鱼症状

病鱼沿池塘四周漫游，呈缺氧状态，活力不强，易捕捉，死亡率达30%。肉眼可见鳍条处有出血症状，体表有淡黄色的圆盘状寄生虫吸附或移行(图1)。镜检鳃部无寄生虫，剖检内脏器官无明显病变。

A.患病大口黑鲈的整体图，箭头指示寄生在体表的鲺； B.大口黑鲈体表病灶图，箭头指示病灶周围的鲺； C.寄生大口黑鲈的鲺(箭头指示)。A. Holistic view of the largemouth bass,arrowheads indicated the parasites; B.The focus of the parasitic infection,arrowheads indicated the parasites; C.Holistic view of the fish louse.

2.2 寄生虫形态特征

镜检观察发现虫体背部有马蹄形背甲，长度略大于宽度，两侧叶上有明显的树状色素条，侧叶末端钝圆，伸达第三游泳足的后缘(图2A)；腹面观虫体背甲前缘和两侧覆盖有尖端向后的小刺(图2B)，由前向后依次为第一触角、第二触角、复眼、吸盘、口器、颚足、游泳足。腹部呈对称的两椭圆状结构，根据腹部中是否含卵或者对称的纺锤状精巢可判断虫体性别(图2A～D)。形态学数据显示，雌性虫体体长1.93±0.46(1.42～2.54)(n=13) mm，背甲大小为(1.17～2.09) mm× (1.00～1.78) mm；雄性虫体体长2.18±0.49(1.57～2.87)(n=11) mm，背甲大小为(1.18～2.08) mm× (1.00～1.96) mm。

A.雌性背面观； B.雌性腹面观； C.雄性背面观； D.雄性腹面观。A. Dorsal view of the female; B. Ventral view of the female; C. Dorsal view of the male; D. Ventral view of the male.

寄生虫各部位形态描述如下：

第一触角(Fa)的基节由2节组成。第1节和第2节的基部各着生1根刺。第2节的基部外侧有一凸起。第2节末端着生1个尖端向腹面的钩状刺。鞭由2节组成，末端着生5根刚毛(图3A)。

第二触角(Sa)由5节组成。在第1节基部有1根刺，在第1到第4节的末端各着生3～4根刚毛。第5节末端着生5根刚毛(图3B)。

小颚特化为吸盘。雌性吸盘几丁质条数为44～52，每条几丁质条由1枚长基片和4～5枚圆形几丁质片组成。雄性吸盘几丁质条数为46～47，每条几丁质条由1枚长基片和6～7枚圆形几丁质片组成(图3C)。

颚足：共5节，第1节基部有3根粗壮的刺，在第1节的腹面有一椭圆状的突起，凸起的表面分布有尖端向后的小刺，在凸起的后缘着生有中间的3根长刚毛和两侧的5根短刚毛。第2节至第5节长度逐渐减小，在第2节的前端至第4节，表面有分叉的倒刺。在第5节末端，着生有2根倒刺和1个指状凸起(图3D)。

A： 触角，无尾箭头示第一触角鞭，有尾箭头示第二触角； B：第二触角； C：吸盘； D：颚足； E：口管； F：游泳足(雄性)； G： 雄性腹部； H：雌性腹部。Eg：卵； Fa：第一触角； Ll：下唇； Sa：第二触角； Sv:精囊； Te：精巢； Ul：上唇。A：Antenna,arrowhead showed the scourge of first antenna,arrow indicated the second antenna; B：Second antenna; C：Sucker,which supportedby sclerites; D：Maxilla; E：Mouth tube; F：Male swimming legs; G：Male abdomen; H：Female abdomen. Eg:Egg; Fa:First antenna; Ll:Lower lip; Sa:Second antenna; Sv:Seminal vesicle; Te:Testis; Ul:Upper lip.

口管呈短圆筒形，位于两吸盘之间。口管由上、下唇组成，上唇(Ul)向腹面呈半圆形，下唇(Ll)形状不规则，在两侧及中间有凸起(图3E)。

游泳足4对。每对游泳足可分为4节，且表面分布有倒刺。每对游泳足在第4节出现2个分支，分支上着生有8根刚毛。在第1对游泳足第2节的内侧，着生有1根刚毛(图3F)。雄性第2游泳足基节腹面有基节突，第三游泳足的内侧有一直径约为200 μm的隆起，为精囊(Sv)。雌、雄虫体在第四游泳足的基节内侧均有一乳头状凸起，在凸起以及第3节上均着生许多刚毛(图3F)。

腹部长度与全长的比值为0.21～0.29，长度略大于宽度(长0.36～0.83 mm，宽0.31～0.65 mm)。中央裂深度为腹长的1/2～1/4。尾叉基位，其上着生4根刚毛。雄性腹部中可见两对称的卵圆形的精巢(T)(图3 G)，雌性成虫腹部中可见未孵化的卵(E)(图3H)。

本研究采集到的物种与鲺属内其他物种的形态测量学指标比较见表1。

表1 本研究物种与鲺属其他物种的形态测量学数据 Table 1 Measurements of Argulus sp. in this study with other species of Argulus

2.3 系统发育分析

获得SSU rDNA基因片段长度1 800 bp，经BLAST比对发现，本研究中日本鲺株系(MW866569)与Arguluscoregoni(JQ740820)、Argulusfoliaceus(JQ740819)、Argulussp. (JN558648)的相似度均为99.84%，与日本鲺(JN558647)和Argulusnobilis(MH458748)的相似度为99.77%，与鲺属内其他物种的相似度在94.00%～99.70%。基于SSU rDNA序列构建ML系统进化树，结果显示，鲺属内物种存在3个支系(Clade)，除JN558647株系外，日本鲺已报道株系均聚为一支(CladeⅠ)，本研究采集的日本鲺(Argulussp.)位于CladeⅠ基部，与日本鲺KF747859和KF747860株系亲缘关系最近(图4)。同时，A.foliaceus(KF747861)和A.rhipidiophorus(747862)也聚于CladeⅠ中，与日本鲺在进化树中呈并系关系。

图4 基于SSU rDNA序列构建的ML系统进化树(本研究物种标星号表示)

3 讨 论

日本鲺引起的鲺病常导致多种水产动物的大量死亡，给水产养殖业造成严重的经济损失[21-23]。大口黑鲈是我国重要的淡水养殖品种，然而，在其寄生虫病的研究中，鲜有鲺病的相关报道。Bauer[24]、Angelina等[25]、Ingham等[26]以及邓国成等[27]开展了大口黑鲈的寄生虫病调查，报道了单殖吸虫、复殖吸虫、绦虫、棘头虫、线虫以及其他甲壳动物寄生虫，但均未发现鲺的寄生。Troxel[28]在加利福利亚州13尾大口黑鲈中检测到1只鲺，并将其鉴定为A.flavescens。Cloutman[29]和Mcalister等[30]分别调查了阿肯色州大口黑鲈的寄生虫感染情况，前者发现并报道了A.mississippiensis的寄生和感染，后者分离到一种形态有所差异的鲺，遗憾的是他们未对该鲺作进一步的鉴定。在我国，梁芝源等[31]在300份患病大口黑鲈样本中检测1种鲺的寄生和感染，但该研究仅限于发现报道，尚未对病原在种级阶元上作出鉴定。本研究在湖北省武汉市的大口黑鲈体表分离到1种鲺，并采用形态学和分子生物学的方法，将其鉴定为日本鲺(A.japonicus)，通过检索资料发现，这是日本鲺寄生大口黑鲈的首次报道。

鲺的物种鉴定主要是通过比较形态学特征的差异，常用的形态特征包括腹部侧叶的形状[1]、吸盘几丁质条数以及几丁质片的数量[7]等。日本鲺腹部侧叶钝圆，可明显区别于腹部侧叶尖形的物种，如A.coregoni[21]以及喻氏鲺(Argulusyui)[7]等(表1)。另外，王耕南[7]、Wadeh等[2]发现日本鲺吸盘的几丁质条通常由3～8个数量不等的几丁质片组成，雄性(3～4)少于雌性(5～8)。本研究发现，雌性个体几丁质片的数量(5～6)与前人研究相符，但是雄性个体几丁质片数量高达7～8，这可能是由于日本鲺处于的发育阶段不同，导致在形态上有所差异[32-33]。A.foliaceus在形态上与日本鲺相似，肉眼观察难以将二者区分。Yildiz等[34]及Noaman等[35]经过观察发现日本鲺和A.foliaceus的区别在于前者背甲的侧叶末端盖过腹部，且腹部中央裂的深度可延伸至中部，这与本研究结果相符。另外，Soes等[5]发现日本鲺的雄性个体的游泳足基部有基节突，而A.foliaceus无此特征。本研究发现雄性个体的第二游泳足有明显的基节凸起(图3F)，进一步证实了Soes等[5]的观点。日本鲺在体色方面也表现出较大差异，本研究中的日本鲺体色淡黄，而在Zoysa等[1]、Wadeh等[2]和王耕南[7]的研究中表现为乳白色，体色的差异可能与宿主的种类及养殖生境有关。

因此，传统的形态学方法鉴定鲺存在一定的难度，尤其是对处于幼体阶段的鲺，几乎无法进行准确鉴定[32]。近年来，分子生物学技术已广泛用于寄生虫的物种鉴定。Sahoo等[36]利用随机扩增多态DNA技术分析了印度13个地区鲺的遗传多样性，发现该技术可以准确区分日本鲺和Argulussiamensis。Patra等[37]利用SSU rDNA序列分析了鲺属内物种的系统发育关系，发现SSU rDNA序列能有效区分该属内的物种。本研究基于SSU rDNA序列构建了ML系统进化树，发现鲺属内物种主要聚为3个支系，拓扑结构与Patra等[37]的相同。然而，日本鲺所在支系(CladeⅠ)中其株系与A.foliaceus和A.rhipidiophorus呈多系类群，日本鲺JN558647株系甚至聚于CladeⅡ中，这给确定日本鲺的系统进化位置带来困难。检索GenBank数据库中的序列信息发现，大部分鲺物种的SSU rDNA序列仅限于序列信息，缺乏相关文献报道的支持，存在误定种的可能。因此，在今后的工作中，应补充更多鲺物种分子数据，同时，结合其他的分子标记探究鲺属物种的系统进化关系。

综上所述，本研究首次报道日本鲺在大口黑鲈体表的寄生，丰富了日本鲺生物学特性的基础数据，增补了大口黑鲈的寄生虫病名录，可为今后大口黑鲈鲺病的诊断和防治提供理论依据。