化学诱变剂EMS和MNU对燕麦种子萌发和幼苗生长的影响

2021-07-26李娟宁吕英赵桂琴柴继宽蔺豆豆王苗苗

草原与草坪 2021年3期

李娟宁，吕英，赵桂琴，柴继宽，蔺豆豆，王苗苗

(1.甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃兰州 730070；2.内蒙古自治区草原工作站，内蒙古呼和浩特 010020)

燕麦(Avenasativa)又称玉麦、铃铛麦，是禾本科燕麦属一年生草本植物，也是优质的粮饲兼用作物，在营养、保健和饲用等方面具有较高的价值，全世界5大洲42个国家都有分布[1]。近年来我国对燕麦的需求不断攀升，进一步推动了燕麦产业的发展。但我国燕麦品种较为单一，满足不同需求的专用品种少，引进品种也因适应性、知识产权等问题难以进一步发挥作用。因此，开展快速有效的育种、创制不同类型的种质、培育不同用途燕麦新品种迫在眉睫[2]。目前国内燕麦新品种选育主要是常规方法，如人工杂交[3]、系统选育[4]等，创造的变异有限、工作量大、耗时较长。与这些方法相比较，化学诱变具有操作简单、成本低廉、突变性状稳定，可以有效解决种质资源单一等优点，是创造植物新种质和选育新品种的有效方法之一[6]。化学诱变可使植物形成自然界没有的或常规方法较难获得的新性状和新基因[10]，同时还避免了转基因等分子育种手段在安全性等方面的问题[11]。

在众多的化学诱变剂中，甲基磺酸乙酯(EMS)和N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)是比较常见的两种化学诱变剂，广泛应用于小麦[12]、大麦[13]、玉米[14]、水稻[15]等化学诱变育种。EMS不同浓度和处理时间对西农99、西农979、西农977和小偃22小麦品种的诱变，发现相对发芽率随着EMS浓度和处理时间的增加而降低，不同处理间差异较大，相对发芽率为50.00%时4个品种的最佳处理组合分别为1.00%/10 h，1.00%/8 h，1.00%/12 h，1.00%/12 h[16]。0.40% EMS处理浙农大3号大麦种子16 h，发现种子受损严重，发芽率显著降低，M1代中部分植株产生致死突变，出苗率较低[17]。0.05%和0.10% MNU处理3个早稻品种(湘早籼33号、R974、R402)和3个晚稻品种(明恢63、R259、湘晚籼13号)12 h，发现水稻发芽指数和活力指数比对照降低，但根长、芽长较对照增加[18]。用0.10% MNU处理14个不同粒型和熟期的黑龙江水稻品种16 h，发现出苗时间普遍推迟3～4 d，发芽率较对照显著降低，其中6个品种的发芽率与对照差值均达60.00%以上[19]。不同化学诱变剂、同一诱变剂不同处理对不同作物或同一作物不同品种的诱变效应各不相同。

在燕麦的化学诱变研究方面，霍朋杰[20]研究了EMS不同浓度和处理时间对花早2号品种的诱变效果，发现在EMS浓度和处理时间对燕麦种子发芽率的影响达显著水平(P<0.05)。当EMS浓度为0.70%处理15 h时，花早2号的相对发芽率约为50.00%。张娜等[21]研究表明，用0.80% EMS处理白燕2号燕麦种子8 h，构建的突变体库M2代个体间表现出了丰富的遗传变异，总变异频率为7.17%。以不同燕麦品种为材料，用EMS和MNU对燕麦种子进行处理，比较2种诱变剂对燕麦种子萌发和幼苗生长的影响，分析不同品种对诱变处理的反应，筛选半致死处理，为进一步开展燕麦化学诱变育种提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 试验地点和材料

试验在甘肃农业大学草业学院实验室进行，供试材料为燕麦品种爱沃、陇燕4号和贝勒2代，均由甘肃农业大学草业学院提供。

1.2 供试药剂

EMS，由英国Johnson Matthey公司生产；MNU由美国SIGMA-ALDRICH公司生产，以上试剂均为分析纯试剂。

1.3 试验设计

1.3.1 诱变剂处理 EMS处理：设5个EMS浓度梯度(0.00%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%，用pH=7的磷酸缓冲溶液配制)，6个时间梯度(5，8，11，14，17，20 h)，重复3次，共计90个处理。每个处理选取籽粒饱满、大小一致的300粒种子分别放入网袋中，在4℃下用蒸馏水浸泡14 h，取出后在室温下4 h沥干，放入编号的玻璃瓶，加入50 mL EMS-磷酸缓冲液置于摇床上，黑暗环境下分别震荡5、8、11、14、17、20 h，然后装入新的网袋用流水冲洗4 h后沥干水分，4℃下静置12 h待用。对照用磷酸缓冲液处理。

MNU处理：设4个MNU浓度梯度(0.00%、0.20%、0.25%、0.30%，用pH=7的磷酸缓冲溶液配制)，3个时间梯度(8、11、14 h)，重复3次，共36个处理。每个组合选取籽粒饱满、大小一致的300粒种子分别放入网袋，在4℃下用蒸馏水浸泡12 h，取出后在室温下4 h沥干，分别放入编了号的玻璃瓶中，加入50 mL MNU磷酸缓冲液，置于摇床上，轻柔震荡8、11、14 h，然后装入新的网袋用流水冲洗4 h后沥干水分，4℃下静置12 h待用。对照用磷酸缓冲液处理。

1.3.2 种子萌发将经诱变剂处理的燕麦种子100粒均匀置于直径9 cm、垫有双层滤纸的培养皿中，然后置于25℃、12 h光照/12 h黑暗、湿度80%恒温培养箱中进行发芽试验。统计每天种子发芽数[22]，第5 d测定发芽势，第10 d试验结束后测定发芽率，每处理取10株幼苗测定芽长和根长[23]，计算相对致死率。

1.4 测定指标及方法

发芽势=高峰时发芽种子总数/种子总数×100%

发芽率=发芽种子总数/种子总数×100%

相对致死率(%)=(对照组发芽率-处理组的发芽率)/对照组的发芽率×100%[12]

根长和芽长：随机选取长势一致的燕麦幼苗10株，用直尺测量读数，取平均值

1.5 数据处理

试验采用Microsoft Excel 2010进行数据整理，用SPSS 19.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 EMS对燕麦种子萌发和幼苗生长的影响

2.1.1 EMS对燕麦种子萌发的影响对EMS不同处理下燕麦品种的发芽势、发芽率和相对致死率进行方差分析(表1)，发现处理浓度、时间和品种及其两两交互作用和三者的交互作用均对燕麦种子的发芽势、发芽率和相对致死率有极显著影响(P<0.01)。品种、浓度、时间、品种×浓度、品种×时间、浓度×时间和品种×浓度×时间所引起的发芽率的差异平方和分别占总平方和的1.77%、89.51%、6.38%、1.37%、0.16%、0.67%和0.15%，所引起的相对致死率的差异平方和分别占总平方和的3.49%、89.14%、4.95%、1.38%、0.18%、0.72%和0.14%，表明诱变剂浓度是造成发芽率和相对致死率差异的最主要因子，其次是处理时间。对发芽势的影响也是如此。

表1 不同EMS处理下燕麦种子发芽势、发芽率和相对致死率的方差分析

诱变剂处理对燕麦种子的萌发有显著影响，最低EMS浓度(0.25%)也降低了种子发芽势和发芽率。随着EMS浓度的进一步增大，3个燕麦品种的发芽势和发芽率进一步急剧下降。当浓度增大至1.00%时，发芽势降至0%～36.25%，发芽率降至0%～45.75%，相对致死率增至49.45%～100%。同一浓度下，随着处理时间的延长，燕麦种子的发芽势和发芽率也显著降低(表2)。

表2 不同EMS处理对燕麦种子萌发的影响

3个品种对同一处理的反应也有明显差异。低浓度(0.25%)处理5 h，爱沃的发芽率为79.50%，和对照相比差异显著，相对致死率为8.04%；陇燕4号的发芽率由对照的80.00%以上降至64.00%，相对致死率达24.48%；贝勒2代发芽率77.00%，相对致死率为14.90%。但当处理时间延长至20 h时，3个品种的发芽率差异很小(40.50%～43.75%)，相对致死率以贝勒2代为最高(52.34%)。另外，和爱沃相比，陇燕4号和贝勒2代在处理时间从11 h延长至20 h时，发芽率和相对致死率无显著变化，而爱沃的发芽率由76%降至43%，相对致死率从9.52%增至44.86%。

中浓度(0.50%)处理下3个品种的发芽率变幅相近，处理时间从5 h延长至20 h，各品种的发芽率降幅均在20.00个百分点左右；但贝勒2代的相对致死率在各个时间点均显著高于其他2个品种。而当EMS浓度进一步增至0.75%时，爱沃随着处理时间的延长发芽率降幅最小(由44.33%降至37.50%)；陇燕4号降幅最大(由44.00%降至31.75%)，相对致死率增幅也最大(由49.70%增至62.26%)。

高浓度EMS严重影响了燕麦种子萌发，导致相对致死率急剧增大。1.00% EMS处理下，燕麦种子发芽率降至45.00%以下，随着处理时间的延长燕麦种子不能萌发，相对致死率达100.00%。

另外，3个品种达到相对致死率50.00%的处理也各不相同。对爱沃而言，0.25% EMS处理17 h、0.75% EMS处理14 h的相对致死率最接近50.00%，分别为49.44%和49.48%。陇燕4号最接近50%相对致死率的处理分别为0.25% EMS处理17 h(相对致死率为49.65%)、0.50% EMS处理14 h(49.85%)、以及0.75% EMS处理5 h(49.79%)。贝勒2代最接近50.00%相对致死率的处理分别为0.25% EMS处理11 h、0.50% EMS处理8 h和0.75% EMS处理5 h，3个处理的相对致死率分别为49.98%、49.86%和49.45%。

2.1.2 EMS对燕麦幼苗生长的影响 EMS不仅严重抑制燕麦种子萌发，还极大地影响了燕麦幼苗的生长。燕麦品种、EMS浓度和处理时间、两两互作以及三者的互作对燕麦幼苗根长和芽长的影响都达到了极显著水平(P<0.01)。3个因素中，EMS浓度的影响最大，其次是处理时间，品种的影响相对较小。在各个互作中，也以浓度和处理时间的互作对各指标的影响最大(表3)。

表3 EMS处理下燕麦幼苗根长和芽长的方差分析

低浓度的EMS有促进燕麦幼苗生长的作用，高浓度则显著抑制了燕麦生长，其根长和芽长急剧降低 (表4)。和对照相比，0.50%以内的EMS显著促进了燕麦的根长和芽长，0.75% EMS处理下总体较对照稍有下降，1.00% EMS处理则严重抑制了燕麦生长，根长和芽长急剧降低，甚至种子不能萌发。

不同品种在同一浓度下随着处理时间的延长，生长的变化情况各异。爱沃的根长在0.25%和0.50% EMS处理下的各个时间点之间没有显著差异，为7.66～8.45 cm；芽长则发生了显著变化，最长为9.92 cm，最短为7.37 cm，相差34.60%。陇燕4号芽长的变化趋势与之类似，但根长(8.92～9.97 cm)变幅只有11.77%。贝勒2代根长和芽长的变幅都较小。当EMS浓度增至0.75%时，随着处理时间的延长，燕麦幼苗的根长和芽长均显著缩短。3个品种中，陇燕4号的根长和芽长降幅最大，分别由处理5 h时的8.12 cm和8.64 cm降至20 h时的6.60 cm和7.15 cm。另外，和陇燕4号(18.72%)、贝勒2代(17.28%)相比，爱沃的根长变幅最小，只有8.65%(表4)。

表4 不同EMS处理对燕麦幼苗根长和芽长的影响

2.2 MNU对燕麦种子萌发和幼苗生长的影响

2.2.1 MNU对燕麦种子萌发的影响对MNU不同处理组合下燕麦种子萌发指标进行方差分析，结果表明，品种、浓度、处理时间及其两两互作和三者互作均极显著(P<0.01)影响了燕麦种子的发芽势、发芽率和相对致死率(表5)。在所有变异来源中，浓度所引起的发芽率、发芽势和相对致死率的差异平方和占总平方和的比例最大，分别为62.76%、63.71%和64.45%；其次为品种，占比分别为21.15%、19.27%和20.72%；处理时间居第3，所引起的发芽率、发芽势和相对致死率的差异平方和占总平方和的比例分别为8.89%，9.21%和7.74%。

表5 不同MNU处理下燕麦种子发芽势、发芽率和相对致死率的方差分析

MNU处理显著降低了燕麦种子的发芽势和发芽率。随着处理浓度的增加，燕麦种子发芽势和发芽率急剧下降，相对致死率显著上升。0.25%浓度下，3个燕麦品种的发芽率由原来的92.67%～98.67%下降至40.00%～85.00%。当MNU浓度增至0.30%时，发芽率进一步降至20.00%～54.75%。同一浓度下，随着处理时间的延长，燕麦种子发芽率总体呈下降趋势(表6)。

表6 不同MNU诱变处理下燕麦种子萌发指标

品种对MNU处理的反应不尽相同。低浓度(0.20%)处理8 h，爱沃的发芽率为94.33%，和对照无显著差异，相对致死率仅为2.07%；而贝勒2代的发芽率已由对照的96.33%降至72.50%，相对致死率达24.74%；随着处理时间延长至14 h，爱沃仍有80.33%的发芽率，相对致死率为15.88%，贝勒2代发芽率已降至48.00%，相对致死率升至48.21%。陇燕4号在0.20%的浓度下随处理时间的延长其变化剧烈，发芽率由8 h时的85.67%降至14 h的45.00%，相对致死率由13.18%增至52.97%。

0.25%MNU浓度下，3个品种发芽率的变化趋势与低浓度下相似，依然是爱沃的发芽率最高且随处理时间延长无明显下降，贝勒2代的发芽率最低。陇燕4号对处理时间的延长最敏感，从8 h时的82.33%降至14 h时的40.67%。相对致死率也发生了相应变化，爱沃的最低，贝勒2代的最高。

当MNU浓度进一步增加至0.30%时，燕麦种子的发芽率降至最低(20.00%～54.75%)。3个品种中爱沃的降幅最大，相对致死率增至42.67%～59.01%；贝勒2代的发芽率为20.00%～30.33%，相对致死率高达68.51%～78.80%。陇燕4号在8 h处理下发芽率(54.33%)高于爱沃(48.00%)，相对致死率(44.94%)低于爱沃(50.17%)，11 h处理下无明显差异，14 h下发芽率显著低于爱沃，相对致死率高于爱沃。

爱沃对诱变剂处理的耐受性较好，发芽率随浓度的增加和处理时间的延长下降比较缓慢，贝勒2代最为敏感，相对致死率最高。另外，3个品种达到相对致死率50.00%的处理也各不相同。爱沃的最相近处理为0.30%/8 h(相对致死率50.17%)，贝勒2代的为0.20%/11 h(相对致死率50.43%)，陇燕4号的最相近处理为0.20%/11 h和0.25%/11 h(相对致死率分别为50.07%和49.64%)。

2.2.2 MNU诱变对燕麦幼苗生长的影响 MNU处理显著影响了燕麦幼苗的生长(表7)。在燕麦品种、EMS浓度和处理时间、两两互作以及三者的互作等变异来源中，浓度对燕麦幼苗根长和芽长的影响最大，其所引起的根长、芽长的差异平方和占总平方和的比例分别为93.26%和93.72%，是最主要的影响因素。另外还可以看出，处理时间对根长无明显影响，但极显著影响芽长。在所有的交互作用中，只有浓度和时间的互作对根长和芽长的影响达显著水平，其余互作并无影响。

表7 MNU诱变剂处理下燕麦根长和芽长的方差分析

与MNU对发芽率的抑制作用不同，一定浓度的 MNU有促进燕麦根、芽生长的作用(表8)。MNU浓度增加到0.20%时，燕麦的根长和芽长均较对照有显著增加。随着MNU浓度进一步增至0.25%，燕麦幼苗的根长和芽长进一步明显增加。最高浓度下，燕麦生长受抑，根长芽长降低，且大多低于对照。另外，同一浓度下，随着处理时间的延长，根长和芽长的变化不尽相同。0.20%浓度下，随着处理时间由8 h延长至14 h，燕麦的根长和芽长都明显增加；0.25%浓度下，随着处理时间的延长，燕麦幼苗的根长未发生明显变化，芽长显著降低；当MNU浓度增大至0.30%时，根长和芽长随处理时间的延长均显著降低。

表8 MNU处理下燕麦种子根和芽生长

不同燕麦品种的幼苗生长对MNU处理的反应基本相似。中低浓度下根长和芽长的增幅比较接近，高浓度(0.30%)下随处理时间的延长，贝勒2代根长降低最多(28.01%)，芽长降低了17.53%；爱沃的芽长仅降低了7.54%。

3 讨论

3.1 不同诱变剂处理对燕麦种子萌发的影响

化学诱变剂由于作用机理、使用浓度和处理时间不同，在不同作物或同一作物不同品种上的诱变效应也各异。EMS是目前应用最为广泛的化学诱变剂，在各类作物上都取得了很好的诱变效果[12]。在牧草上，用不同浓度的EMS处理羊草种子“吉生4号”，结果发现其对羊草种子萌发具有显著抑制作用，随着浓度的增加，羊草种子发芽率、发芽指数等呈降低趋势；1.50% EMS处理后羊草种子相对发芽率降到51.68%，1.80% EMS处理的发芽率比对照降低67.50%，发芽指数降低了44.00%[24]。本研究也得到了类似结果，EMS处理显著降低了燕麦种子的发芽势和发芽率，浓度效应非常明显。当EMS浓度增大至1.00%时，发芽率降至0%～45.75%，相对致死率增至49.45%～100%。同一浓度下随着处理时间的延长，燕麦种子的发芽势和发芽率也显著降低。通过不同EMS浓度和处理时间诱变无芒隐子草种子，发现随EMS浓度的增加和处理时间的增长，无芒隐子草种子发芽率显著降低[25]。以“川草2号”老芒麦为材料,利用不同浓度(0.20%、0.40%、0.60%、0.80%、1.00%、1.20%和1.60%)的EMS溶液分别处理老芒麦种子8 h和16 h，发现随着EMS浓度和处理时间的增加，老芒麦的起始发芽日和发芽高峰日推后，发芽势和发芽率下降趋势明显[26]。采用0.90% EMS处理15 h对缘毛雀麦种子萌发无显著影响，但延长处理3 h后则有显著抑制作用；直立型扁蓿豆种子在处理45 h时相对发芽率显著下降[27]。

MNU不同浓度处理燕麦种子后，发芽率显著降低，相对致死率上升。0.25%浓度下，燕麦的发芽率由原来的92.67%～98.67%下降至40%～85%。当MNU浓度增至0.30%时，发芽率降至20.00%～54.75%。另外，同一处理浓度下随着处理时间的延长，燕麦种子发芽率总体呈下降趋势。在水稻上也得到了类似结果，用0.05%和0.10% MNU处理水稻12 h，发芽指数和活力指数比对照显著降低[28]。用0.10% MNU处理水稻种子16 h，发现水稻的发芽率较对照显著降低，出苗时间推迟3～4 d[29]。

EMS和MNU的作用机理类似。EMS带有活性烷基，可以转移到电子密度比较高的分子上，置换碱基中的氧原子，当碱基烷化后，就会导致DNA在复制时错配[30]。MNU也是通过作用于核酸底物，对DNA上的鸟嘌呤起烷化作用，引起复制紊乱[34]。二者在抑制燕麦种子萌发方面具有极显著的浓度效应。不同化学诱变剂对不同燕麦品种的诱变效应不同，中低浓度(0.25%～0.75%) EMS处理下，爱沃的耐受性较好，发芽率较高，相对致死率最低，而贝勒2代最敏感，相对致死率最高。MNU处理也得到类似结果，中低浓度(0.20%～0.25%)下爱沃发芽率一直较高，贝勒2代最低。高浓度下各品种反应一致，发芽率急剧下降，相对致死率显著上升。不同种类和浓度的化学诱变剂对燕麦种子的发芽刺激作用相同，低浓度促进种子的萌发，而高浓度显著抑制种子萌发。探究其原因，一方面可能是EMS和MNU化学诱变剂对燕麦种子胚的诱变伤害较轻，不像物理诱变的抑制或损伤效果强烈。另一方面可能是低浓度短时间的EMS和MNU化学诱变剂能够加速吸水后的燕麦种子细胞呼吸和新陈代谢作用，吸水后的燕麦种子在高浓度的化学诱变剂 EMS和MNU浸种，长时间的浸泡处理下可能产生了负作用，打断了种子的正常呼吸代谢过程，从而抑制了燕麦种子的发芽萌动。

不同诱变剂对不同燕麦品种的半致死处理也不相同。通常认为，半致死浓度是诱变处理的合适浓度，可作为诱变敏感性指标[35]。EMS处理下，爱沃的半致死最佳处理组合是0.25%/17 h和0.75%/14 h；陇燕4号的是0.25%/17 h、0.50%/14 h和0.75%/5 h；贝勒2代的分别为0.25%/11 h、0.50%/8 h和0.75%/5 h。而羊草对EMS的耐受性远强于燕麦，其半致死处理为1.50%/16 h[24]。还有研究发现，用EMS诱变无芒隐子草，其半致死处理为0.80%/16 h[25]。老芒麦的EMS半致死处理也是0.80%/16 h[26]。而缘毛雀麦和直立型扁蓿豆的分别为0.90%/18 h和0.90%/48 h[27]。淮扬金花菜的EMS半致死处理分别为0.70%/9 h和0.90%/6 h[36]。可见不同牧草的EMS半致死处理各不相同，但总的规律是低浓度长时间或高浓度短时间。MNU处理下，爱沃的半致死处理为0.30%/8 h，贝勒2代的为0.20%/11 h，陇燕4号的为0.20%/11 h。研究发现利用MNU诱变湘早籼33号、To974和R402早稻种子的半致死处理为0.10%/12 h；明恢63、R259和湘早籼13号晚稻种子半致死处理为0.05%/12 h[37]。

3.2 不同诱变剂处理对燕麦幼苗生长的影响

诱变剂除了抑制燕麦种子萌发外，对幼苗的生长也有显著影响。在品种，诱变剂浓度和处理时间、两两互作以及三者的互作等变异来源中，浓度对燕麦幼苗根长和芽长的影响也最大。EMS在低浓度下有促进燕麦幼苗生长的作用，高浓度则显著抑制了幼苗生长，其根长和芽长急剧降低。0.50%以内的EMS显著促进了燕麦的根长和芽长，0.75% EMS处理下总体较对照稍有下降，1.00% EMS处理则严重抑制了燕麦生长，根长和芽长急剧变短乃至种子不能萌发。而在羊草上，EMS处理对羊草幼苗生长只有明显的抑制作用，表现为根长、芽长降低，没有促进作用[24]。EMS诱变处理对淮扬金花菜的根长也有抑制效应，但低浓度EMS处理后淮扬金花菜保持了较高的越冬率，高浓度则降低了金花菜的越冬率[36]。

MNU对燕麦幼苗生长的影响与EMS类似，也出现低浓度促进、高浓度抑制的现象。MNU浓度为0.20%时，燕麦的根长和芽长均较对照有显著增加。随着MNU浓度进一步增至0.25%，燕麦幼苗的根长和芽长进一步明显增加。最高浓度下，燕麦生长受抑，根长芽长降低，且大多低于对照。采用0.05%和0.10% MNU处理湘早稻和晚稻品种12 h，0.05%浓度处理具有提高水稻种子发芽率、发芽势、活力指数以及促进晚稻种子根和幼芽生长的作用，与对照相比，经诱变处理后早稻品种种子根长和芽长的生长量的变幅大于晚稻品种[28]。用1.00 mmol/L MNU处理水稻两性生殖细胞40 min，发现M1代出苗率、成株率均与MNU浓度及处理时间呈负相关[38]。由于诱变剂的损伤和削弱性，EMS和MNU在低浓度下有促进燕麦幼苗生长的作用，高浓度则显著抑制了燕麦幼苗生长。探究其原因可能是吸水后的燕麦种子在低浓度的化学诱变剂的刺激下，燕麦种子中分解酶对种子中贮藏的营养物质快速分解，转运到胚，供胚利用，种皮加速软化，有利于胚根和胚芽突破种皮；而高浓度的诱变剂则可能产生毒害作用。