体外诊断试剂参考区间技术审评常见问题及建议

张莉莉 张苏琳 唐力 王文娟 戴清 江苏省食品药品监督管理局认证审评中心 （江苏 南京 210002）

内容提要： 参考区间是定量体外诊断试剂的重要参数。从技术审评的角度分析企业在确定参考区间过程中常见的问题并提出几点建议，旨在提高企业设计开发效率和临床评价成功率。

近年来我国体外诊断试剂产业快速发展，回顾过去几年我省体外诊断试剂申报注册受理量可知，呈逐年递增之势，且增速明显。然而从申报注册主体的角度讲，体外诊断试剂的生产企业普遍规模比较小，产品注册专员和研发人员的流动性大，整体素质有待于进一步提高，这也制约了体外诊断试剂行业发展。与此同时，生产企业对注册申报相关的法规、标准以及相关指导原则掌握得还不够全面，注册申报资料在合规性性等方面仍存在较多问题。本文主要就二类体外诊断试剂定量产品的参考区间确定资料，从技术审评的角度谈一些常见的问题以及建议。

根据我国医疗器械监管法规要求，第二类体外诊断试剂产品在上市前应进行注册审评审批，注册申报资料应符合《医疗器械监督管理条例》（国务院令第680号）、《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局第5号）、原国家食品药品监督管理总局《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（2014年第44号）等相关配套法规规章文件的要求。其中上述44号公告相关附件对体外诊断试剂产品各注册类型所需提交的注册资料，作出了具体要求。其中参考区间确定资料即为重要申报资料之一。然而部分企业在产品设计开发阶段过多的重视产品临床性能评价，而忽视了对产品各性能指标及重要参数做全面而系统的研究评价。定量体外诊断试剂产品的关键参数之一即为参考区间。从逻辑的角度来讲，准确地建立定量体外诊断试剂产品的参考区间可以大幅度的提高临床评价结果满足评价指标的概率，反之可能对临床评价结果造成不利影响，甚至可能导致整个研发工作重头再来，这不仅费时费力，也对生产企业带来巨大资金压力。

1.参考区间概念及注册申报基本要求

中华人民共和国卫生部标准WS/T 402-2012中指出：参考区间（Reference interval）两参考限之间（包括两参考限）的区间。注1：参考区间是指从参考下限到参考上限的区间，通常是中间95%区间。在某些情况下只有一个参考限具有临床意义，通常是参考上限，这时的参考区间是0到参考上限。注2：参考区间在我国通常又称为“参考范围”“正常范围”“正常值”等，但“参考区间”是目前国际通用规范术语[1]。

原国家食品药品监督管理总局《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（2014年第44号）中要求企业提供的定量体外诊断试剂参考区间确定资料：应当详细说明参考区间确定的方法或依据，说明确定参考区间所采用的样本来源，并提供参考区间确定的详细试验资料及总结[2]。

2.参考区间技术审评常见问题及建议

2.1 注册资料中参考区间确定方法不明确或不合理

很多企业在体外诊断试剂拟注册产品申报资料中提供的参考区间确定资料没有明确表述该产品参考区间的确定方法是什么，资料中直接给出试验方案，实验数据以及试验结果。还有部分企业，可能出于研发成本及时效的考虑，在参考区间确定资料中，提供引用文献或者其他企业同类产品说明书，以表明引用文献中数据作为该产品参考区间或者转移其他企业同类产品参考区间作为该产品参考区间。资料中缺少对引用文献数据或转移其他企业同类产品参考区间适用性的分析和必要的临床样本验证。

美国临床实验室标准化协会（CLSI）的EP28-A3文件中指出，定量体外诊断试剂参考区间确定方法一般有：①建立参考区间，②转移参考区间，③验证参考区间[3]。

建立参考区间，包括所有的步骤，从选择参考个体开始，通过准确的统计学方法分析收集的数据，最终得出结论。适用情况有：①新分析物参考区间的建立；②不同群体参考区间的建立；③灵敏度和特异性提高了的新的分析方法参考区间的建立。

转移参考区间，使已建立好的参考区间适用于新的检测系统或新的检测人群的过程。适用的情况：预先已检测过的分析物参考区间的建立，即把一个实验室的参考区间转移到另一个实验室。但是需要待测试的群体和分析系统相同或者具有可比性，转移才能被认可和接受。可接受参考区间转移的必要条件包括：检测系统的可比性；检测人群的可比性。选择这种方法确定产品参考区间时，需要先对试验系统与比对系统进行方法学比对试验和偏差评估，只有相关系数和偏倚在规定的范围内，才可转移。

验证参考区间，即通过相对较少的参考个体，将其他地方建立或转移的参考区间在当地使用的合理过程。适用于验证建立的或转移的参考区间是否可接受。目前，建议三种方法用来评估参考区间转移的可接受性：①主观验证；②使用少量的参考个体验证（如，n≥20）；③使用大样本量的参考个体验证（但少于建立参考区间需要的n≥120）。选择这种方法确定产品参考区间，需要考虑接收实验室的操作必须和原始参考值研究的分析前和分析中各因素的控制保持一致[4]。

2.2 研究参考区间时样本的入排标准设立不具体，千篇一律，对分析物无针对性

企业申报资料，经常可以发现一个现象，尤其是同一个生产企业的申报资料，即便是不同检测指标，其参考区间确定资料中研究样本的入排标准却一模一样，缺乏对分析物或临床适应症的针对性，这就对后期参考区间研究结果的准确性造成了隐患。

一般来说，参考区间研究的样本为表观健康人群。需要确立统一的，具体的选择和排除标准，从而选择“相对健康”的参考个体。因研究临床检测分析物不同，所设计的排除标准也各不相同。通常避免直接选用一般意义上的年轻又健康的成年人，可以选用非常类似于患者群的人群。如果分析物对参考个体有分组的必要性，可以建立分组标准，将全部筛选出来的参考个体，按照有意义的分类法进行分组，例如按年龄、性别、月经周期或孕周期等进行分组。此外检测样本的具体情况，也应该在研究参考区间时纳入考虑，例如不同样本类型的样本应分别进行研究，如尿液、血液、脑脊液等。不同采血位置应分别进行研究，如指尖血、静脉血等。

2.3 参考区间研究样本量不符合统计学要求

部分企业不清楚参考区间研究样本量如何确定，没有从产品自身特性、影响因素出发，直接设定某个数量，从而收集样本进行分析统计，这样的研究方法是不科学的，研究结果也会遭到质疑。

研究检测指标参考区间时，首先要考虑该检测指标的临床含义，从而决定参考区间报告结果是单侧范围或双侧范围。参考区间指的是两个数（含这两个数）之间，即最高限和最低限的之间的全部数组成的区间，从参考人群中抽出来的个体检测值可以用一个特定的百分比（通常是95%）来评估。故双侧区间可取第2.5和第97.5个百分位点；单侧上限取95%百分位点；单侧下限取5%百分位点[4]。

参考区间研究样本量一般依据计算参考样本组的百分位数值的置信区间（CI）来识别和评定，如果待测物属于双侧指标，按照公式（1）计算确定样本数量[4]。

如参考区间取单侧下限或单侧上限，以5%或95%位置计参考限，按照公式（2）进行计算确定样本数量[4]。

2.4 参考区间研究中统计分析不完善或不合理

企业申报资料中参考区间统计分析常见问题有：①原始数据纳入统计的科学性和有效性未保证，部分超出线性范围或低于线性范围的数据直接纳入统计，未作说明，不能保证统计结果的准确性。②原始数据未作离群值分析，直接进行后续统计计算。③原始数据分布类型未确定，不能保证选择的计算方法是否科学有效，不能保证研究结果的准确性。

针对上述参考区间确定资料中的几点统计分析问题，从技术审评的角度，提出几点建议：①企业研究者应保证参考区间研究中纳入统计的原始数据科学有效，对于低于线性范围的数据不应纳入统计，对于超出线性范围的数据，应做说明，阐述清楚这部分数据如何得来，如稀释后检测，回乘稀释倍数所得等。②无论采用哪种方法建立参考区间，均应进行离群值检验。如有离群点被剔除，应补充样本量至所设置的最少样本量。③原始数据分布类型不同，运用的参考区间计算方法也不同。根据EP28-A3、WS/T402-2012以及国内的研究资料，可将参考区间的估计方法分为两种，正态分布法（参数法）和百分位点法（非参数法）。

正态分布法参考区间的计算方法见表1[4]。

表1. 正态分布参考区间计算方法

百分位数法参考区间的计算方法见表2。

表2. 百分位数法参考区间计算方法

3.小结

本文主要总结和分析了企业产品申报资料中参考区间确定过程中的常见问题，并结合技术审评工作中审查该部分资料关注的要点，给出几点建议，供行业内相关人员学习、参考、与交流。建议生产企业在设计开发阶段，结合产品的临床预期用途和产品的技术特点，选择科学的方法，准确建立产品的参考区间，提高产品设计开发的效率以及临床试验成功的概率。