重庆地区一线抗反转录病毒治疗失败HIV-1感染者耐药情况的回顾性研究

鲁雁秋，王 静，陈耀凯，李俊刚

抗反转录病毒治疗（antiretroviral therapy，ART）是目前治疗HIV-1感染的最有效手段，也是控制病毒传播的主要措施之一。目前，全球已有2 600万HIV-1感染者正在接受ART[1-2]。然而，随着ART的广泛开展，抗病毒药物耐药问题日益凸显[3]。法国接受ART的感染者随访6年的总体耐药率为11.7%[4]。我国山东省接受ART满1年人群耐药率达6.2%[5]，云南、广西和河南三个省份报道的HIV-1 耐药率约为7.1%[6]。迄今尚未见重庆地区HIV-1耐药情况的大样本研究。为此，本课题组对2015年5月—2020年6月在重庆市公共卫生医疗救治中心接受一线ART且发生病毒学失败的HIV感染者进行回顾性分析，以了解本地区HIV-1耐药情况。

1 材料与方法

1.1 标本来源

2015年5月—2020年6月，本中心共收治HIV-1感染者3 305例，其中接受ART 1年以上且病毒载量大于1 000 拷贝/mL者为348例。所有348例病例均留取EDTA-K2抗凝血浆5mL，进行HIV-1病毒载量检测、基因扩增、耐药分析和基因亚型分析。

1.2 检测方法

1.2.1 HIV-1病毒载量检测 采用全自动实时荧光定量检测仪（COBAS Taq-Man48，德国罗氏公司产品），定量检测血浆HIV-1 RNA水平（最低检测下线值为20拷贝/mL）。

1.2.2 HIV-1基因扩增和耐药分析 血浆标本采用ViroSeq HIV-1基因型耐药检测试剂盒（美国Abbott公司产品）进行HIV-1 RNA提取，经实时荧光定量（RT）-PCR扩增出包含全部蛋白酶基因和三分之二反转录酶基因的片段（长度为1.8 kb），然后以扩增片段为模板采用7条引物分别测序；用ViroSeq HIV-1耐药分析软件（The ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software）对7个引物测得序列进行拼接、编辑以及对拼接序列进行突变确认，再把拼接序列同HIV-1参考毒株（HXB-2）序列进行比对分析，以此来确认样本的突变位点；最后，采用ViroSeq HIV-1耐药分析软件选择合适的数学模型对这些突变位点进行分析并生成耐药报告。

1.2.3 HIV-1基因亚型分析 采用美国国立生物技术信息中心 （NCBI）网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）提 供 的病毒基因分型工具（Viral Genotyping Tool）进行HIV-1基因亚型分析，选择2009年参考序列数据库（2009 RefSet）进行在线比对，根据比对结果判定序列所属HIV-1基因亚型。

1.2.4 统计学分析 采用Excel 2016进行数据收集，所有分析均使用统计软件SPSS 21.0进行。计量资料用均数表示，计数资料用频率（%）表示，率的比较采用卡方检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料

3 305例接受一线ART方案治疗满1年的HIV-1感染者中，348例（10.5%）一线ART方案治疗病毒学失败，在失败的病例中，男270例（77.6%），女78例（22.4%），平均 年 龄40.7岁（4～74岁）；治疗满1年时血浆HIV-1病毒载量均值为4.9 lg拷贝/mL （3.0 ～7.0 lg拷贝/mL）。其中，检出HIV-1耐药的319例HIV-1感染者中，男248例（77.7%），女71例（22.3%），平均年龄40.0岁（4～74岁）。本组348例病例接受的一线ART方案包括替诺福韦酯+拉米夫定+依非韦仑（TDF/3TC/EFV）、替诺福韦酯+拉米夫定+奈韦拉平（TDF/3TC/NVP）、齐多夫定+拉米夫定+依非韦仑（AZT/3TC/EFV）和齐多夫定+拉米夫定+奈韦拉平（AZT/3TC/NVP）。

2.2 耐药率分析

348例发生病毒学失败病例中，319例至少对一种抗反转录病毒药物耐药，在348例一线ART方案治疗失败病例中占91.7% （319/348），未检出任何耐药的比例仅为8.3%（29/348）。在检出耐药的319例中，核苷类反转录酶抑制剂（NRTI）耐药发生率为91.5%（292/319），非核苷类反转录酶抑制剂（NNRTI）耐药发生率为99.1%（316/319），蛋白酶抑制剂（PI）耐药发生率为0.9%（3/319）。常见NRTI和NNRTI类药物耐药率详见图1。

图1 319例耐药病例对NRTI和NNRTI类药物的耐药率Figure 1 The incidence of resistance to NRTIs and NNRTIs in 319 cases

2.3 耐药位点分析

发生耐药突变的319例病例中，共检出17个NRTI耐药位点突变、16个NNRTI耐药位点突变和9个PI耐药位点突变。由表1可见，NRTI类药物中，M184V/I突变发生率最高（85.9%），其次为K65R/N（41.7%）；NNRTI类药物中，K103N/R/S突变发生率最高（43.6%），其次为G190A/S/E/Q、V179D/E和V106M/A，分 别 为38.6%、38.2%和33.9%；PI类药物各种突变发生率均很低（＜1%）。

表1 319例耐药病例的耐药基因位点分布及频数Table 1 The distribution and prevalence of drug resistance mutations in 319 cases

2.4 耐药病例HIV-1基因亚型分布

319例耐药病例中，HIV-1基因亚型以CRF01_AE亚型最多，达170例（53.3%），其次是CRF07_BC亚 型96例（30.1%）、CRF08_BC亚 型17例（5.3%）、B亚 型12例（3.8%）和CRF55_01B亚型13例（4.1%），其 余 占 比 不 足1%亚 型 包括CRF52_01B、CRF57_BC、CRF59_01B、CRF67_01B、CRF15_01B、CRF64_BC和D亚 型等（图2）。与耐药病例比较，治疗病毒学失败但未检出耐药者HIV-1基因亚型分布基本相同，差异无统计学意义（P＞0.05）；但非耐药病例CRF08_BC亚型分布频数（24.1%）显著高于耐药病例（5.3%）,差异具有显著统计学意义（P=0.001）。见图3。

图2 319例耐药病例HIV-1基因亚型分布Figure 2 The distribution of HIV-1 subtypes in 319 drugresistant cases

图3 治疗病毒学失败病例中耐药与非耐药病例HIV-1基因亚型分布频率的比较Figure 3 The distribution and prevalence of drug-resistant and wild-type HIV-1 subtypes in the patients failing antiretroviral therapy

3 讨论

本研究显示，重庆地区HIV-1感染者ART治疗1年后，一线方案病毒学失败率达10.5%，耐药率达9.7%，明显高于我国山东、云南、河南和广西等地区的耐药率数据[5-6]，也明显高于泰国[7]、印 度[8]等发展中国家报道的耐药率监测结果（5.0%左右）。本组319例耐药病例的耐药分析结果显示：①NNRTI类药物耐药率接近100%，其中NVP、DLV和EFV耐药率都在95%以上，而新一代NNRTI代表药物ETR耐药率则明显较低（39.5%）；②NRTI耐药发生率低于NNRTI，但仍达91.5%，其中3TC和FTC耐药发生率最高（接近90%），AZT耐药发生率最低（仅11.0%），常用药物TDF耐药率亦达47.0%；③PI耐药发生率极低，仅3例（0.9%）检出PI耐药位点突变。以上结果提示：①我院HIV-1耐药情况较为严重，应引起足够重视；②对一线ART药物产生耐药是导致本地区HIV-1感染者病毒学失败的主要原因；③我院HIV-1耐药最为严重的药物包括3种NNRTI类药物（NVP、DLV、EFV）和2种NRTI类药物（3TC、FTC）；④AZT和PI类药物由于耐药屏障高，耐药情况尚不严重，特别是PI类药物耐药发生率极低；⑤TDF和ETR作为新一 代NRTI与NNRTI类药物的代表品种，虽然耐药率显著低于老一代品种，但40%左右的耐药率仍具有警示意义。至于本组病例耐药率较高的原因，可能本中心为重庆地区最大的艾滋病抗病毒治疗定点机构，管理的重症病例和晚期病例较多有关，因为此类病例往往耐药发生率较高。

本研究耐药突变位点分析显示，M184V/I和K65R/N是最常见的NRTI类药物基因突变位点，而NNRTI类药物常见的基因突变位点包括K103N/R/S、G190A/S/E/Q、V179D/E和V106M/A等。M184V/I突变会导致HIV-1对3TC和FTC产生高度耐药性，且接受3TC和TDF方案者M184V/I突变发生率显著高于接受FTC和TDF方案者[9-11]。我国免费抗病毒药物目录中并无FTC供应，这可能是我国HIV-1感染者易发生M184V/I突变的原因之一。K65R/N突变可导致HIV-1对3TC、FTC、DDI和ABC敏感率明显下降，但对AZT和D4T无影响[12-13]。M184V/I和K65R/N两突变位点的高频率分布可解释本组病例广泛存在的对3TC、FTC和ABC等药物的高度耐药性。NNRTI类药物常见的耐药突变位点在本组病例中均有检出，其中K103N/R/S、G190A/S/E/Q、V179D/E和V106M/A 4种 突变的发生频率均在40%左右，多种突变位点单独或组合存在都可导致病毒对NVP、DLV和EFV的高度耐药[14-15]，这可解释本组病例NNRTI类药物耐药性极高的现象。

本研究还发现，在一线ART治疗失败的HIV-1感染者中，无论是否存在耐药，HIV-1亚型均以CRF01_ AE、CRF07_BC、CRF08_BC、B、CRF55_01B为5种主要的流行亚型，而CRF52_01B、CRF57_BC、CRF59_01B、CRF 67_01B等亚型少见，这与苏迎盈等[16]、陈孙云等[17]调查结果相符，提示HIV-1基因亚型与耐药发生无显著关联。虽然我们发现病毒学失败但未检出耐药的感染者CRF08_BC亚型更多见，但由于本组病例样本量不大，尚不易判断其临床意义。

总之，本研究通过对348例一线ART方案治疗1年后出现病毒学失败的HIV-1感染者以及其中319例检出病毒耐药病例的回顾性研究，发现重庆地区一线ART治疗失败患者耐药发生率高，耐药是HIV-1感染者病毒学失败的主要原因；耐药最为严重的药物包括NVP、DLV、EFV、3TC和FTC，AZT耐药情况尚不严重，PI类药物耐药发生率极低；耐药与HIV-1基因型无相关性。然而，本组部分病例存在临床资料不齐全，虽不至于影响主要结果的分析，但仍是本研究作为回顾性研究的不足之处。