MTHFR基因C677T多态性与冠状动脉支架植入术后再狭窄的相关性研究

陈宁，孙婷，陈明

经皮冠状动脉介入治疗（PCI）是临床治疗冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）的有效手段，支架植入后能够有效增加冠状动脉（冠脉）血流、减轻心肌缺血症状。术后发生支架内再狭窄是影响PCI效果的重要因素，传统金属裸支架植入后6个月内再狭窄的发生率约20%～30%，使用药物涂层支架后再狭窄的发生率虽有所下降、但仍会对患者的远期预后造成不利影响。PCI后再狭窄的发生与支架植入对冠脉局部血管壁、内膜等结构的损害有关，结构损害局部再内皮化不足、血管平滑肌细胞过度增殖会逐步引起管腔再狭窄[1,2]。炎症反应是目前已知参与心血管疾病各个环节的病理因素，同时也被证实与内皮细胞损伤、血管平滑肌细胞增殖有关，多项研究报道：血清炎症指标超敏C反应蛋白（hs-CRP）、血清淀粉样蛋白AA（SAA）、高迁移率族蛋白B1（HMBG1）、白介素-33（IL-33）的升高与PCI后支架内再狭窄的发生有关的[3-5]，但调控再狭窄过程中炎症反应的机制仍未明确。

高同型半胱氨酸（Hcy）血症是近年来新发现的心血管疾病危险因素，Hcy是甲硫氨酸代谢过程的副产物，对内皮细胞具有损害作用、对炎症反应具有刺激作用。亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）是参与甲硫氨酸循环调节的催化酶，MTHFR催化活性的改变会造成Hcy水平升高。MTHFR基因在多个位点存在多态性，其中C677T位点多态性会使编码产物中的丙氨酸被缬氨酸取代并改变编码产物的催化活性[6]，该多态性已被证实是冠心病发生的危险因素，但与支架植入后再狭窄的关系尚未明确。本研究具体分析了MTHFR基因C677T多态性与冠脉支架植入术后再狭窄的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2018年1月～2019年6月于解放军第九六〇医院心内科接受PCI的160例冠心病患者为研究对象，入组标准：①冠脉前降支、回旋支、右冠中至少1支狭窄70%以上；②PCI后靶血管管腔扩大、残余狭窄＜30%；③随访时间6个月以上。排除标准：①服用叶酸、维生素B12等影响Hcy代谢药物的患者；②合并结缔组织病、恶性肿瘤的患者。根据PCI后6个月时冠脉CTA的结果进行分组，支架内狭窄≥50%的患者为再狭窄组、＜50%的患者为无再狭窄组。再狭窄组64例，其中男性36例，女性28例，年龄42～62岁、平均55.51±7.84岁，吸烟33例，合并高血压35例、糖尿病25例；无再狭窄组96例，其中男性54例，女性42例，年龄40～63岁、平均54.57±8.12岁，吸烟37例，合并高血压34例、糖尿病27例。两组间一般资料比较无显著性差异（P＞0.05）。

1.2 MTHFR基因C677T多态性检测方法PCI前采集肘静脉血2 ml，枸椽酸钠抗凝后采用基因组DNA提取试剂盒提取肘静脉血中的基因组DNA，设计MTHFR基因C677T位点的引物后配置PCR反应体系，模板DNA 2 μl、2XMaster Mix 25 μl、引物各2 μl 、去离子水补足至50 μl。按照94 ℃变性45 s，60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s的PCR程序反应40个循环，取PCR产物进行基因测序，根据测序结果判断多态性。

1.3 再狭窄特征的观察PCI后6个月时，采用64排双源CT仪进行冠脉CTA检查，扫描范围为主动脉弓肺动脉节段起始、至膈肌下1 cm为止；将感兴趣区设置在升主动脉、当CT值达到100 HU时触发

2 结果

2.1 再狭窄组、无再狭窄组患者MTHFR基因C677T多态性的比较再狭窄组患者MTHFR基因C677T位点CT+TT基因型的比例及T等位基因的比例明显高于无再狭窄组，CC基因型的比例及C等位基因的比例明显低于无再狭窄组，差异有统计学意义（P＜0.05），表1。

表1 再狭窄组、无再狭窄组患者MTHFR基因C677T多态性的比较

2.2 再狭窄组中不同MTHFR基因C677T多态性患者再狭窄特征的比较再狭窄组中MTHFR基因C677T位点CT+TT基因型患者的支架内膜覆盖面积、支架内膜覆盖面积百分比、最大内膜组织覆盖厚度均明显高于CC基因型患者，差异有统计学意义（P＜0.05），表2。

表2 再狭窄组中不同MTHFR基因C677T多态性患者再狭窄特征的比较

2.3 再狭窄组中不同MTHFR基因C677T多态性患者血清实验室指标的比较再狭窄组中MTHFR基因C677T位点CT+TT基因型患者的血清Hcy、hs-CRP、SAA、HMGB1、IL-37含量明显高于CC基因型患者，FA、VitB12含量明显低于CC基因型患者，差异有统计学意义（P＜0.05），表3。

表3 再狭窄组中不同MTHFR基因C677T多态性患者实验室指标的比较

3 讨论

扫描，扫描参数为电压120 kV、电流280 mA、层厚0.75 mm、机架旋转时间0.28 s、球管旋转时间0.33 s/r。将图像信息录入影像工作站后，计算支架内膜覆盖面积、支架内膜覆盖面积百分比、最大内膜组织覆盖厚度。

1.4 血清指标检测PCI前采集肘静脉血3～5 ml后离心分离血清，采用酶循环法试剂盒测定叶酸（FA）、维生素B12（VitB12）的含量，酶联免疫吸附试剂盒测定超敏C反应蛋白（hs-CRP）、血清淀粉样蛋白A（SAA）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、白介素-37（IL-37）的含量。

1.5 统计学分析采用SPSS 20.0软件统计及分析数据，计量资料采用平均数±标准差不表示，组间比较采用t检验。计数资料采用百分比表示，组间比较采用卡方检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

支架内再狭窄直接影响冠心病患者PCI的疗效，支架局部再内皮化不足、血管平滑肌细胞过度增殖是与再狭窄发生密切相关的因素[7,8]。支架植入后能够有效扩张冠脉管腔、恢复心肌血供，但会造成局部血管内膜损伤，内皮细胞在内膜损伤部位浸润能够完成再内皮化、保证局部内膜结构完整；而当内皮细胞在炎症反应、氧化应激等作用下发生损伤时，再内皮化过程无法正常完成，再内皮化不足会增加血小板在局部黏附、活化并形成血栓的风险，进而逐步形成支架内再狭窄。支架局部再内皮化不足有利于血管平滑肌细胞的黏附，在炎症细胞因子的刺激下血管平滑肌细胞不断增殖，进而加重支架内狭窄的程度。炎症反应在再内皮化障碍及血管平滑肌细胞增殖中均起到重要作用，因而hs-CRP、SAA、HMGB1、IL-37等炎症指标的升高也被用于预测PCI后支架内再狭窄的发生风险大[9,10]，但再狭窄过程中炎症反应的调控机制并未完全阐明。

高Hcy血症是近年来新发现的心脑血管疾病危险因素，Hcy能够通过促炎、增加自由基生成、促凋亡等多个途径参与粥样斑块形成[11,12]。Hcy是甲硫氨酸代谢循环中产生的副产物，在辅因子FA、VitB12存在的条件下被甲硫氨酸合成酶转化为甲硫氨酸，当以上代谢途径发生异常时，Hcy发生蓄积、含量升高。MTHFR是参与甲硫氨酸代谢循环的催化酶，能够将5, 10-二甲基四氢叶酸转化为有生物学活性的5-甲基四氢叶酸并在Hcy合成为甲硫氨酸的过程中提供甲基。MTHFR的编码基因在C677T位点具有多态性，容易出现C向T的突变，发生突变后编码产物的丙氨酸被缬氨酸取代、催化活性明显下降[13,14]。MTHFR具有C677T多态性已经被证实与冠心病的发生有关，本研究分析了该多态性与支架内再狭窄的关系，结果显示：再狭窄组患者MTHFR基因C677T位点CT+TT基因型的比例及T等位基因的比例明显高于无再狭窄组，CC基因型的比例及C等位基因的比例明显低于无再狭窄组。进一步分析支架内再狭窄患者MTHFR基因C677T多态性与再狭窄特征的关系可知：发生C向T突变的CT+TT基因型患者具有更大的支架内膜覆盖面积、支架内膜覆盖面积百分比、最大内膜组织覆盖厚度。这一结果提示MTHFR基因C677T位点C向T突变增多与支架内再狭窄的发生密切相关且会加重狭窄的严重程度。

MTHFR基因C677T多态性直接影响编码产物的催化活性，进而使Hcy代谢过程受到影响。Hcy代谢过程中Hcy升高及VitB12、FA减少已被证实与PCI后的支架内再狭窄有关，本研究进一步分析了支架内再狭窄患者MTHFR基因C677T多态性与Hcy代谢的关系后发现：发生C向T突变的CT+TT基因型患者的血清Hcy含量明显升高，FA、VitB12含量明显降低，提示支架内再狭窄患者MTHFR基因C677T位点C向T的突变能够影响Hcy代谢，引起Hcy增多。Hcy具有较强的促炎活性，通过刺激hs-CRP、SAA、HMGB1、IL-37等炎症指标的升高来影响再狭窄过程中的再内皮化、血管平滑肌细胞增殖。hs-CRP、SAA是由肝脏合成并分泌的炎症标志物，HMGB1和IL-37是单核巨噬细胞、淋巴细胞分泌的具有促炎活性的细胞因子[15,16]，本研究对支架内再狭窄患者MTHFR基因C677T多态性与炎症指标的关系进行了分析，结果显示：发生C向T突变的CT+TT基因型患者的血清hs-CRP、SAA、HMGB1、IL-37含量明显升高，提示支架内再狭窄患者MTHFR基因C677T位点C向T的突变能够在增加Hcy含量的基础上激活炎症反应、刺激多种炎症自指标大量释放。

综上所述，MTHFR基因C677T位点C向T的突变与冠状动脉支架植入术后再狭窄的发生密切相关，该突变能够影响Hcy代谢、增加Hcy含量并激活炎症反应。本研究的局限之处在于未对冠脉支架植入术的预后进行长期随访，未能阐明MTHFR基因C677T位点多态性与长期预后的关系。