沙坦类药物代谢酶CYP2C9的基因遗传多态性在高血压患者中的分布特征

王申，张舜华，薛薇，王鹏飞，任格，陈传军

高血压是一种严重危害人类健康水平的多发病，它主要是由于遗传基因和生活环境共同引起的。血压水平与心脑血管病发病和死亡风险之间存在密切的因果关系，血压水平与心力衰竭、心房颤动、终末期肾病发生也存在因果关系。它不仅给患者带来了严重生理伤害，且给家庭和社会带来沉重的经济压力。中国高血压调查最新数据显示[1]。2012～2015年我国18岁及以上居民高血压患病粗率为27.9%，我国高血压患者的知晓率、治疗率和控制率近年明显提高，但总体仍处于较低水平，分别达51.6%、45.8%和16.8%。由于高血压受遗传基因的影响，因此，国内外相关学者开始将与高血压相关的敏感基因作为研究对象，研究发现，与疾病相关的易感基因在个体内差异很大[1]。接受药物治疗的患者中20%～50%血压未得到良好控制。研究表明药物代谢酶、转运体和受体（药物作用靶点）的遗传变异是造成个体药物反应差异的主要原因。有研究表明CYP2C9是导致氯沙坦氧化的主要P450同工酶，CYP2C9基因型变异导致了氯沙坦氧化和活化的个体间差异[2]。本研究通过研究影响沙坦类抗高血压药物代谢CYP2C9*3基因的频率差异，评估这些基因的遗传变异在高血压患者的分布特征，为进一步指导高血压病的个体化治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象与分组本实验选取2018年～2019年就诊于北京大学航天中心医院全院的原发性高血压患者1236例，其中男性684例，女性552例，年龄45～76（63±8）岁。高血压纳入标准（2018年中国高血压防治指南）：收缩压（SBP）≥140 mmHg，舒张压（DBP）≥90 mmHg（1 mmHg=0.133kPa）；排除标准：继发性高血压；肝肾功能不全；明显心功能不全、糖尿病及严重心脑血管疾病等。

1.2 方法

1.2.1 样本收集方法本实验按照世界卫生组织（WHO）、联合国教科文组织（UNESCO）生物伦理委员会（IBO）等有关《关于DNA取样、控制和获得的声明》的要求，签订“知情同意”收集高血压的血样。采用EDTA抗凝的真空采血管，抽取受检者外周静脉血3～5 ml，使用天根生化科技（北京）有限公司的TIANamp Genomic DNA Kit血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）DP304提取基因组DNA。

1.2.2 DNA制备吸取20 μl蛋白酶K至1.5 ml离心管的底部；加入200 μl待提取基因组的样品至离心管中；加入200 μl Buffer GB至样品中，涡旋振荡15 s混匀；完全混匀以得到均一化的溶液对于保证样品的充分裂解很重要；70℃孵育10 min。DNA得率在该条件下已经达到最大值，延长孵育时间不会进一步提高得率；快速离心，去除残留在1.5 ml离心管盖子中的液滴；加入200 μl（样品等体积）的无水乙醇，涡旋振荡15 s混匀。振荡完毕后，快速离心，去除残留在1.5 ml离心管盖子中的液滴；将得到的混合物转移至吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），扣上盖子12 000 rpm，离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入500 μl缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm（～13 400×g）离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入600 μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm（～13 400×g）离心30 sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；重复操作上一步骤；将吸附柱CB3放回收集管中，12 000 rpm（～134 00×g）离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200 μl（建议70 μl）洗脱缓冲液TE，室温放置2～5 min，12 000 rpm（～13 400×g）离心 min，将溶液收集到离心管中。

1.2.3 CYP2C9＊3基因型检测使用无锡锐奇基因生物科技有限公司的CYP2C9*3检测试剂盒（PCR-熔解曲线法）在Gentier 96E全自动医用PCR分析系统（西安天隆科技有限公司）进行PCR熔解曲线分析。按一定顺序向配制好的PCR扩增反应试剂中分别加入2 μl提取好的核酸、阴阳性对照品。做好标记，盖紧反应管，2000 rpm离心10 sec后进行PCR熔解曲线分析。扩增循环参数：95℃预变性2 min，进入94℃变性30 s，56℃复性32 s，72℃延伸30 s循环，共50个循环。扩增产物进入熔解阶段，设置46～75℃，每个温度收集荧光，荧光检测通道选择FAM和ROX。

1.3 统计学处理使用SPSS 22.0统计软件进行分析。群体遗传平衡运用Hardy-Weinberg平衡定律。两组间均数比较用t检验，计数资料使用频数（百分数）表示，采用χ2检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 CYP2C9＊3（c.1075A＞C）基因多态性结果分析1236例高血压药物治疗的患者中，针对其CYP2C9*3（c.1075A＞C）基因位点的多态性进行检测，通过分析比较所产生的熔解曲线Tm值的变化，进行SNP分型。只出现1个熔解峰时为纯合型（包括野生纯合、突变纯合），同时出现2个峰时为杂合型（图1）。

图1 CYP2C9*3 c.1075 A＞C位点基因型熔解曲线峰图

只出现1个低Tm值熔解峰的样本，CYP2C9*3 c.1075 A＞C位点为野生型纯合子（A/A），出现2个Tm值熔解峰的样本为突变型杂合子（A/C），只出现1个高Tm值熔解峰的样本为突变型纯合子（C/C）（表1）。

表1 CYP2C9*3 c.1075 A＞C位点基因型

2.2 高血压患者CYP2C9＊3不同基因型、等位基因频率分布情况1236例高血压患者中，发现CC基因型5例，高血压组中的等位基因A的频率为95.11%，等位基因C为4.89%，高于国人健康人群中的发生频率（表2）。

表2 北京地区1236例高血压患者CYP2C9*3不同基因型、等位基因频率分布情况

2.3 不同性别间高血压组CYP2C9＊3基因型、等位基因频率分布情况AA、AC+CC基因型以及等位基因A与C的发生频率间在性别间的差异都无统计学意义（P＞0.05）（表3）。

表3 不同性别间高血压组CYP2C9*3基因型、等位基因频率分布情况

2.4 不同年龄组间高血压组CYP2C9＊3基因型、等位基因频率分布情况根据年龄分为青中老年（≤64岁）、老年组（≥65岁）分为2组，得出青中老年（≤64岁）、老年组（≥65岁）间CYP2C9*3基因型、等位基因发生频率差异无统计学意义（P＞0.05）（表4）。

表4 不同年龄组之间高血压组CYP2C9*3基因型、等位基因频率分布情况

3 讨论

CYP2C9位于人体常染色体10q24.2上，总长大约55 kb，其中含有8个内含子，9个外显子，CYP2C9基因编码有490个氨基酸、其编码蛋白质分子量约为55kD。CYP2C9*3基因突变，它是在CYP2C9第7号外显子的第1075位置，碱基A突变为碱基C，导致在其编码的蛋白质一级结构的第359位置上，异亮氨酸（ILe）被亮氨酸（Leu）所取代。CYP2C9的等位基因目前发现有10多种，其基因型发生改变有可能会导致该基因表达的酶活性发生根本变化。因此CYP2C9基因发生突变就可能引起CYP2C9酶的空间结构与功能发生根本改变，最终会致使CYP2C9酶活性出现下降甚至丧失，所以就会造成对其底物的代谢清除能力发生根本变化。CYP450酶系作为多数药物的代谢酶，其存在高度多态性，基因位点突变则可能导致该酶的活性变化。经CYP2C9酶代谢的抗高血压药物有血管紧张素受体拮抗药，常见的如氯沙坦、厄贝沙坦等，研究发现CYP2C9基因多态性不仅会降低氯沙坦等治疗高血压的疗效，而且还会影响与它种药物联合使用的效果[3,4]。本文对近2年就诊于我院的高血压人群及的 CYP2C9*3基因多态性分布频率及其与高血压的关系进行了分析。

本研究发现，在1236名高血压患者中，发现CC基因型患者5例，等位基因C在高血压患者中的发生率为4.89%，在不同性别及年龄间的分布无统计学差异，P＞0.05。虽然女性等位基因C的发生率（1.98%）低于男性等位基因C的发生率（2.91%），但两者差异无统计学意义，P＞0.05，提示对携带CYP2C9*3的高血压患者在服用沙坦类降压药物时，应重视由CYP2C9*3突变而造成降压类药物疗效降低的风险，应减少用药剂量。

国外研究得出CYP2C9*3的等位基因频率在非洲裔美国人和亚洲人中分别为1.0%～3.6%和0.5%～1.5%[5,6]。Craig R Lee等研究得出白种人的CYP2C9 *1/*3的发生率在11.6%，CYP2C9 *3/*3为0.4%，CYP2C9 *1/*1的发生率在65.3%[7]。国内研究得出CYP2C9*3中的等位基因C的频率在1.6%～3.2%，与正常非高血压人群相比无统计学差异，相关的研究中都未发现CYP2C9 *3/*3突变纯合子型（CC型），考虑入组患者人数少有关[8.9]。而我们在1236名高血压患者中发现5例CYP2C9 *3/*3突变纯合子型（CC型）患者，考虑为入组人群数量大相关。

Yu等[5]对湖南长沙地区的239例高血压人群和265例正常人群进行了CYP2C9*3检测后发现，高血压人群中女性携带CYP2C9*3 的频率低于正常人群，具有统计学差异，P＜0.01，并认为携带CYP2C9*3的女性可能是高血压病的保护性因子，且在既往的研究中也报道过CYP酶存在性别的差异[10,11]。在我们的研究中，女性高血压组中CYP2C9*3携带者比例低于男性高血压患者以及文献报道的正常人群，这可能由于入选的女性患者较少于男性患者有关，另外国外Donner等[14]通过研究发现CYP2C9*3携带者在高血压男性患者中肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS系统）活性较低，在原发性高血压男性中，CYP2C9*3对氯沙坦的抗高血压的效应没有影响。CYP2C9*3的存在与需要更高剂量的氯沙坦有关，这是由于氯沙坦向其活性产物E-3174的转化率有一定程度的降低[15]。基于国内外研究，针对性别间的差异可为药物治疗提供了有用的指导价值，至于性别间药物剂量等详细数据仍需进一步的研究。

本研究首次检测了北京地区高血压人群与高血压病药物治疗及代谢相关的CYP2C9*3基因位点的多态性，对于高血压病的个体化治疗提供了基础的指导意义。在临床工作中，对于携带CYP2C9*3等位基因的患者，在使用沙坦类药物时由于其酶活的减弱，对底物的代谢作用也可能减弱导致血药浓度增加，药物作用时间加长，故应减少用药剂量，减少用药频率，从而降低不良反应的发生。对于CYP2C9 *3/*3纯合子（CC型）的高血压患者，因对沙坦类药物的代谢作用很弱，建议换用其它适用的降压药物[16]。对于CYP2C9*3基因位点不同基因型的高血压患者服用沙坦类降压前后的对比差异，我们在后续文章会进一步做回顾性分析。