渔业养殖水体中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留量的检测方法研究

2021-07-21杨盈悦朱羽庄梅光明李晋成

浙江大学学报(理学版) 2021年4期

杨盈悦，朱羽庄，梅光明，李晋成

（1.浙江海洋大学食品与药学学院，浙江舟山316021；2.浙江省海洋水产研究所，浙江舟山316021；3.浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山316021；4.中国水产科学研究院，北京100141）

孔雀石绿和结晶紫是人工合成的三苯甲烷类染料，由于价格低廉且具有较好的驱虫和杀菌效果，曾在水产养殖中被广泛用于环境消毒和治疗水霉病、腮霉病等［1-2］。孔雀石绿和结晶紫容易代谢转化为化学性质更稳定、毒性更强的隐色孔雀石绿和隐色结晶紫，在生物体和环境中代谢缓慢、残留时间长。研究表明，孔雀石绿、结晶紫及其代谢物均致癌、致畸和致突变［3-4］，因此，包括我国在内的很多国家都将孔雀石绿和结晶紫列为禁用药物［5］。由于孔雀石绿和结晶紫曾被广泛使用，造成部分养殖环境被污染，经常有养殖户反映，在养殖过程中并未使用孔雀石绿类药物，却在产品中被检出，推测可能由环境中的历史残留引起。目前，对孔雀石绿的监测主要集中在水产品终端［6-8］，对渔业养殖水体环境中的孔雀石绿类污染状况关注较少。为监测并掌握孔雀石绿污染情况，保障养殖水产品的质量安全，有必要建立一套对养殖水体中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的检测方法。

水体中孔雀石绿的常用检测方法有液相色谱法［9-11］、酶联免疫法［12］、液质联用法［13-15］、荧光探针法［16⁃17］、纳米电化学传感器法［18］等。其中，液质联用法无论在定性判断上或在定量的准确性上均具绝对优势，其他方法存在特异性不强、容易出现假阳性和检测限较高等缺点，且现有方法中可检测到的目标物很少能覆盖孔雀石绿和结晶紫及其代谢物4种组分。本文以二氯甲烷液液萃取结合活塞式中性氧化铝分散固相萃取净化，以氘代同位素物为内标物，采用超高效液相色谱-串联质谱法，实现了对养殖水体中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留量的快速准确检测，为对渔业养殖水体的环境监测提供了方法和分析手段。

1 实验

1.1 仪器与试剂

实验所用仪器为ACQUITY H-Class UPLC–xevo TQS串联质谱仪（美国Waters公司）；Centrifuge 5810高速离心机（德国Eppendorf公司）；R-210型旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司出品）；MS2漩涡混合器（德国IKA公司）。

实验所用试剂为Milli-Q超纯水系统制备的高纯水；乙腈（色谱纯，Merk公司）；甲酸（色谱纯，sigma公司）；乙酸铵（色谱纯，美国TEDIA公司）；盐酸羟胺（分析纯，上海国药集团公司）；孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）和隐色结晶紫（LCV）标准品（纯度均在98%以上）（德国Dr公司）；氘代孔雀石绿（MG_D5）、氘代隐色孔雀石绿（LMG_D6）、氘代结晶紫（CV_D6）、氘代隐色结晶紫（LCV_D6）标准品（纯度均在98%以上）（德国WITEGA公司）；中性氧化铝SPE填料（100～300目）、C18SPE填料（40～63μm）和PSA QuEChERS专用填料（40～63μm）（上海安谱公司）。

1.2 溶液配制

目标物标准储备液和混合外标物标准使用液的配置：分别准确称取适量的MG、LMG、CV、LCV标准品，用乙腈溶液溶解并定容，配成浓度为100μg·mL-1的目标物标准储备液，于-18℃冷冻保存。再用乙腈将4种目标物标准储备液稀释为0.1μg·mL-1的混合目标物标准使用液，于-18℃避光保存。

内标物标准储备液和混合内标物标准使用液的配置：分别准确称取适量的MG_D5、LMG_D6、CV_D6和LCV_D6标准品，用乙腈溶解并定容，配成浓度为100μg·mL-1的内标物标准储备液，于-18℃冷冻保存。再用乙腈将4种内标物标准储备液稀释为0.1μg·mL-1的混合内标物标准使用液，于-18℃避光保存。

1.3 实验方法

1.3.1 水样预处理

按采样点均匀分布原则，在每个养殖水域采集3个水样，各500 mL，充分混合后抽滤，去除悬浮物等固形物。

量取水样100 mL，置于500 mL分液漏斗中，加入20μL浓度为0.1μg·mL-1的混合内标物标准使用液和2 mL 20%的盐酸羟胺溶液，再加入50 mL二氯甲烷，剧烈振摇萃取5 min，静置30 min，分层后取下层二氯甲烷于150 mL梨形瓶中，再向分液漏斗加入50 mL二氯甲烷，重复萃取一次（若分层不明显，取其下层液于50 mL离心管中，6 000 r·min-1离心3 min，再取下层液），将两次萃取的二氯甲烷合并置于40℃水浴减压浓缩至近干，用1 mL乙腈复溶，拉动活塞式分散固相萃取净化柱（装填中性氧化铝粉末50 mg，预先用2.5 mL乙腈冲洗柱子）抽取复溶液，推动活塞并接收流出液，再加入5.0 mmoL·L-1乙酸铵溶液并定容至2.0 mL，过0.22μm有机相滤膜后供UPLC-MS/MS仪测定。

1.3.2 色谱及质谱条件

色谱条件：Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；柱温40℃；进样量5μL；流动相由5 mmol·L-1乙酸铵缓冲溶液（用甲酸调节p H为4.5，A）和乙腈（B）组成；梯度洗脱程序：0～1.50 min、5%～50%A（线性改变），1.50～3.50 min、5%A，3.50～4.00 min、5%～50%A（线性改变），4.0～5.0 min、50%A；流速0.3 mL·min-1。

质谱条件：电喷雾正离子（ESI+）模式；毛细管电压1.70 k V，源补偿电压50 V；脱溶剂温度600℃；脱溶剂气流量600 L·h-1，锥孔气流量150 L·h-1；雾化压力0.7 MPa；多反应监测（MRM）扫描模式。目标物母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量和扫描时间等质谱多反应监测条件见表1。MG、LMG、CV和LCV分别以MG_D5、LMG_D6、CV_D6和LCV_D6为内标物，按照内标法由MassLynx软件自动计算质量分数。

表1 质谱多反应监测条件Table 1 MRM conditions for mass spectrometry

2 结果与分析

2.1 液相色谱与质谱分析条件的确定

2.1.1 液相色谱条件的确定

以Acquity UPLC BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）为液相色谱分离柱，5 mmol·L-1乙酸铵缓冲溶液（含甲酸0.1%）和乙腈为流动相，在梯度洗脱程序下，可将渔业养殖水体中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色孔雀石绿和隐色结晶紫4种目标物与样品基质完全分离，无干扰，在5 min内全部出峰，且色谱峰型明显，峰响应强度高，0.2μg·L-1的混合标准溶液响应强度可达到e5，见图1。

2.1.2 质谱分析条件的确定

在ESI+模式下，分别将0.1μg·mL-1的MG、LMG、CV、LCV、MG_D5、LMG_D6、CV_D6和LCV_D6标准品溶液通过蠕动泵进样，采用一级质谱分析MS SCAN，得到各目标物的母离子信息，并对子离子进行二级质谱分析，得到碎片离子信息，同时进一步优化锥孔电压和碰撞能量等参数，使母离子和子离子的响应最大化。优化后的质谱多反应监测条件如表1所示。

2.2 水样前处理条件的确定

2.2.1 前处理方法的选择

水体中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物浓度低，对目标物进行富集以降低检测限。在目前已有的关于水体中孔雀石绿类测定的文献中，多采用液液萃取法［19］或固相萃取法［20-21］进行样品前处理。固相萃取法在去除杂质和降低基质干扰上有较大优势，但在常规操作中，若取样体积过小，易出现富集倍数不足和灵敏度较低的问题；若为提高富集倍数和降低检出限而增大取样体积，则会增加固相萃取操作的复杂性，使检测时长大大增长，影响检测效率。考虑渔业养殖水体基质相对简单，待测组分孔雀石绿、结晶紫及其代谢物在有机溶剂中溶解性好，因此选择液液萃取法进行水样前处理。液液萃取法操作简单，不必用固相萃取中成本相对较高的SPE小柱，检测成本低；还可通过大体积取样提高目标物的富集倍数，达到降低检出限的目的，对富集后的样品进行吸附除杂，有利于降低基质干扰。

2.2.2 液液萃取条件的确定

孔雀石绿、结晶紫及其代谢物在二氯甲烷中均有很好的溶解性，且二氯甲烷在水中的溶解度低，因此选择二氯甲烷作为反萃取试剂进行液液萃取。在100 mL水样中分别添加10μL浓度为0.10μg·mL-1的MG、LMG、CV和LCV的4种混合目标物标准使用液（添加浓度约为10 ng·L-1）和20μL浓度为0.10μg·mL-1的混合内标物标准使用液，二氯甲烷的萃取体积分别为30，40，50，60，70 mL，进行样品前处理，结果见图2。由图2可知，当萃取体积为50 mL时，4种目标物的平均绝对回收率较高，继续增大萃取体积，回收率提高不明显，因此，选择50 mL作为萃取体积。

图1 0.2μg·L-1的混合标准溶液MRM色谱图Fig.1 MRM chromatogram of 0.2μg·L-1 standard solution

图3为分别用50 mL二氯甲烷液液萃取1，2，3次时4种目标物的平均绝对回收率情况。由图3可知，萃取2次时的平均绝对回收率较萃取1次时有明显提高，但萃取3次时的平均绝对回收率较萃取2次时无明显改善，因此，选择萃取2次。

图4为采用50 mL二氯甲烷液液萃取2次、振荡时间分别为2，3，5，6和8 min时4种目标物的平均绝对回收率情况。由图4可知，在振荡时间为2～5 min时，随单次振荡时间的增加，平均绝对回收率均逐渐提高；当振荡时间超过5 min后，继续增长振荡时间，平均绝对回收率无明显提高，因此，选择单次振荡的时间为5 min。

2.2.3 分散固相萃取净化条件

采用2 mL活塞式分散固相萃取净化柱，拉动活塞将复溶液转移至含有净化填料的净化柱，推动活塞将净化后的提取液转移至离心管，加入5.0 mmoL·L-1乙酸铵缓冲溶液（0.1%甲酸）并定容至2 mL，过0.22μm滤膜后上机分析。分别装填50 mg乙二胺-N-丙基硅烷颗粒（PSA）、50 mg十八烷基键合硅胶颗粒（C18）和50 mg中性氧化铝，并比较经3种填料吸附除杂后的平均绝对回收率（见图5）。由图5可知，C18对LMG、LCV的吸附作用较强，导致二者的平均绝对回收率很低；PSA对4种目标物均有一定的吸附作用，且对MG、CV的吸附作用强于LMG和LCV；中性氧化铝的整体吸附作用优于PSA和C18，对4种目标物的吸附作用较小，平均绝对回收率较高。渔业养殖水体的基质相对较简单，但考虑部分水样可能存在因含较多的水藻、残留饵料及水体富营养化带来的基质干扰效应，可用活塞式中性氧化铝分散固相萃取净化柱进行净化，此方法操作简单，对水体中色素类杂质具有明显的吸附除杂作用，从而降低基质干扰，提高分析物的绝对回收率。

图2 萃取体积对平均绝对回收率的影响Fig.2 Effect of extraction volume on average absolute recovery

图3 萃取次数对平均绝对回收率的影响Fig.3 Effect of extraction times on average absolute recovery

图4 萃取时间对平均绝对回收率的影响Fig.4 Effect of extraction time on average absolute recovery

图5 不同填料净化方式对平均绝对回收率的影响Fig.5 Effect of different packing purification methods on the average absolute recovery

2.3 方法确认

2.3.1 准确度和精密度

在浙江省舟山市朱家尖某大黄鱼养殖场采集水样，经检测不含MG、CV及其代谢物。将其作为空白水样，进行不同添加浓度的加标回收率实验，考查方法的准确率（以内标法计算加标回收率）和精密度。取100 mL样品，设置4个加标水平，每个加标水平设6个平行组，每个加标水平重复3次，添加浓度、加标回收率及精密度测定结果见表2。结果表明，在养殖海水基质5～100 ng·L-1添加浓度下，MG、CV及其代谢物的平均加标回收率为81.8%～109.5%，批内精密度和批间精密度均小于10%，表明该方法的准确度高、重复性好。

2.3.2 方法的检测限及线性范围

分别配制MG、LMG、CV和LCV 4种目标物工作浓度为0.20，0.50，1.0，2.0和5.0μg·L-1，其中MG_D5、LMG_D6、CV_D6和LCV_D6内标物浓度均为1.0μg·L-1。用4种目标物峰的质谱响应强度和浓度绘制标准曲线，计算相关系数，以信噪比（S/N）为3的响应强度的目标物浓度作为方法检测限，以S/N≥10，且回收率大于70%的浓度作为方法定量限。4种目标物的曲线方程及相关系数、检测限与定量限如表3所示。由表3可知，MG、LMG、CV和LCV在0.2～5.0μg·L-1浓度范围内曲线方程均呈较好的线性关系，相关系数大于0.998，方法检测限和定量限分别为2.0 ng·L-1和5.0 ng·L-1。

表2 养殖海水中MG、CV及其代谢物的加标回收率与精密度实验（n=6）Table 2 Recovery and precision test of MG，CV and metabolites from aquaculture seawater when n=6

表3 MG、LMG、CV和LCV的工作曲线方程Table 3 Working curve equations of MG，LMG，CV and LCV

2.3.3 实际样品验证

用40 L的鱼缸养殖鲫鱼数尾（体重为100～150 g·尾-1），用人为添加MG和CV污染浓度均为25.0μg·kg-1的配合饲料连续投喂4 d，投喂量为鱼体重的1/20，2 d后对养殖水样按照本研究方法进行测定，结果发现，水样中均检出MG、LMG、CV和LCV，浓度分别为0.007 1，0.025 0，0.008 4和0.028 0μg·L-1。结果表明，本方法能满足渔业养殖水体中MG、CV及其代谢物痕量检测要求。

另外，结合笔者团队承担的浙江省养殖鱼产品质量安全监测任务，同时对21处水产养殖水体进行了取样检测。结果发现，某地的1份乌鳢养殖水体中检出LMG，浓度为0.006 7μg·L-1，该地生产的乌鳢样品中也检出LMG，浓度为1.550 0μg·kg-1。

2.4 标准溶液稳定性实验

标准溶液稳定性对检测结果的准确率至关重要，因此对标准溶液的储存有效期进行了探究。将新配置的100μg·mL-1标准储备液分装，密封后于-18℃冷存，每隔30 d取出1瓶，恢复至室温后稀释至1.0μg·L-1，用液质进行测定，记录每次测定的峰面积，同时测定新鲜配制标准溶液的峰面积。以每次新鲜配制溶液的峰面积为基准（100%），记录在30～240 d时相应组分的峰面积，计算并比较峰面积比例，用以表征标准储备液的稳定性，见图6。由图6知，MG贮存时间在180 d内时，峰面积为新鲜配制溶液峰面积的99.2%～95.7%，贮存时间在210和240 d时，峰面积分别为新鲜配制溶液峰面积的93.2%和92.1%；LMG贮存时间在180 d内时，峰面积为新鲜配制溶液峰面积的99.5%～97.3%，贮存时间在210和240 d时，峰面积分别为新鲜配制溶液峰面积的96.2%和94.3%；CV贮存时间在180 d内时，峰面积为新鲜配制溶液峰面积的98.5%～95.4%，贮存时间在210和240 d时，峰面积分别为新鲜配制溶液峰面积的94.7%和92.4%；LCV贮存时间在180 d内时，峰面积为新鲜配制溶液峰面积的99.1%～96.2%，贮存时间在210和240 d时，峰面积分别为新鲜配制溶液峰面积的95.7%和94.2%；MG_D5贮存时间在180 d内时，峰面积为新鲜配制溶液峰面积的98.5%～95.0%，贮存时间在210和240 d时，峰面积分别为新鲜配制溶液峰面积的93.4%和92.1%；LMG_D6贮存时间在180 d内时，峰面积为新鲜配制溶液峰面积的98.2%～95.2%，贮存时间在210和240 d时，峰面积分别为新鲜配制溶液峰面积的93.1%和91.7%；CV_D6贮存时间在180 d内时，峰面积为新鲜配制溶液峰面积的98.4%～94.2%，贮存时间在210和240 d时，峰面积分别为新鲜配制溶液峰面积的93.8%和92.0%；LCV_D6贮存时间在180 d内时，峰面积为新鲜配制溶液峰面积的98.5%～94.7%，贮存时间在210和240 d时，峰面积分别为新鲜配制溶液峰面积的93.2%和90.7%。因此确定8种标准储备液在-18℃条件下的贮存时间不宜超过180 d。

图6 标准储备液稳定性研究Fig.6 Study on stability of standard reserve fluid

将新配制的0.1μg·mL-1的混合目标物标准使用液和混合内标物标准使用液分装，密封后于-18℃下冷存，每隔2 d取出1瓶，恢复至室温后稀释至1.0μg·L-1，用液质进行测定，记录每次测定的峰面积，同时测定新鲜配制标准溶液的峰面积。以新鲜配制溶液的峰面积为基准（100%），记录不同取样时间测定的相应组分的峰面积，计算并比较峰面积比例，以表征标准使用液的稳定性，见图7。由图7知，贮存时间在34 d内，MG峰面积为新鲜配制溶液峰面积的99.6%～92.7%，LMG峰面积为新鲜配制溶液峰面积的99.5%～94.3%，CV峰面积为新鲜配制溶液峰面积的99.6%～89.4%，LCV峰面积为新鲜配制溶液峰面积的99.3%～93.7%，MG_D5峰面积为新鲜配制溶液峰面积的99.1%～89.4%，LMG_D6峰面积为新鲜配制溶液峰面积的99.6%～90.2%，CV_D6峰面积为新鲜配制溶液峰面积的99.5%～92.7%，LCV_D6峰面积为新鲜配制溶液峰面积的99.7%～93.1%；贮存时间为30 d时，MG、LMG、CV、LCV、MG_D5、LMG_D6、CV_D6和LCV_D6的峰面积分别为新鲜配制溶液峰面积的94.2%，95.2%，93.9%，94.2%，93.6%，93.9%，94.1%和94.2%。因此，确定8种标准使用液在-18℃条件下的贮存时间不应超过30 d。