日本无针乌贼胚胎期眼部发育相关基因的研究

李少刚，李永芹,2，许乐乐,2，陈道海,2，王锂韫,2,3

( 1.岭南师范学院 生命科学与技术学院，广东 湛江 524048； 2.广东省粤西海鲜资源可持续利用工程技术研究中心，广东 湛江 524048； 3.广东省特殊儿童发展与教育重点实验室，广东 湛江 524048 )

日本无针乌贼(Sepiellajaponica)属软体动物门、头足纲、十腕目、乌贼科、无针乌贼属，因其高度进化、发展并集中的神经系统，被认为是研究眼睛形态发育的模式生物[1]。在胚胎发育过程中，有关头足类动物光敏度的研究表明，在孵化前，胚胎在视网膜最终分化之前会变得光敏[2-3]。与其他头足类动物不同，乌贼卵周围有黑色的包膜，从而减弱了进入胚胎的光线，乌贼胚胎会在黑暗的视觉环境中发育，当眼部器官分化到第一个视网膜色素出现的时期，乌贼胚胎对光照做出反应[4-8]。目前针对日本无针乌贼胚胎期眼部发育的研究多集中于外源性因素，如光照、饲料、药物等，而关于转录水平调控机制对日本无针乌贼胚胎期眼部分化的影响却鲜有报道。

多细胞生物视觉结构的形态发生受到一个保守的基因转录控制网络所调控[9]。在基因转录控制网络中，paired-box 6(pax6)是高度保守的转录因子家族paired-box的成员之一[10-11]，也被认为是控制眼睛形态发生的通用基因，有研究表明，其在多细胞生物眼睛光敏感受器的发育过程起到重要作用[12-13]。除pax6之外，SIX Homeonox 3 (six3)、Eyes Absent (eya)基因也参与了多细胞生物视细胞的增殖、视网膜前体的分化、光敏感受器神经元的分化和维持，以及其他非视网膜组织和器官的发育过程[14-17]。笔者在日本无针乌贼胚胎不同发育期转录组测序分析的水平[18]上进一步探讨与日本无针乌贼胚胎眼部发育过程相关调控基因six3、eya及pax6的表达变化。

不同研究者对乌贼胚胎发育的分期各有不同，刘振勇等[19]将乌贼受精卵到出膜幼体分为22期；蒋霞敏等[20]从胚胎的受精卵阶段至孵化阶段将乌贼卵的发育过程分为12个阶段；von Boletzky等[21]则将从受精卵到形态结构与成体基本相似的乌贼的胚胎发育分为30个时期。综合参考上述分期方法，笔者拟将日本无针乌贼胚胎发育过程分为3个时期、8个阶段，并对不同发育阶段乌贼胚胎中的six3、eya、pax6基因相对表达水平进行分析。

刚孵化的乌贼对视觉或气味的提示会立即做出反应并能表现出对某些重复视觉刺激的习惯，表明乌贼胚胎在孵化之前的发育过程中便能探测到刺激[6,22]。笔者探讨分子水平日本无针乌贼胚胎期眼部发育相关调控基因的表达变化，旨在查明乌贼相关调控基因对眼睛发育的影响机制，为探究乌贼的视觉机制，如乌贼快速适应伪装的视觉机制，同时为日本无针乌贼胚胎的人工繁育和增养殖提供分子水平数据参照。

1 材料与方法

1.1 样品采集

当天产卵的日本无针乌贼卵采自中国南海汕头海域，转移至实验室乌贼孵化养殖缸中培养，养殖缸规格0.4 m×0.2 m×0.3 m，乌贼卵附着于尼龙绳上, 并在下方用塑料篮盛起，24 h人工增氧。孵化用水为砂滤海水，水温(28±1) ℃，盐度27±1，pH 7.5～8.2，连续充气，每日换水，换水量为养殖缸的1/3[23]。

自获得乌贼卵当日起，观察和记录每日培育状况及养殖环境。同时，随机挑取3～5颗乌贼卵，在体视显微镜(Nikon SMZ800N，Tokyo，Japan;目镜C-W10×B/22，物镜 Plan Apo 1×WF WD:70)下观察和记录，并进行分期及细分阶段。每个阶段取50颗乌贼卵，迅速用预冷的PBS溶液(Rnase free)冲洗，然后将每个卵分别保存于液氮预冷的灭菌密封袋中，立即置于液氮中冷冻3 h，置于-80 ℃超低温冰箱冻存备用。

1.2 总RNA提取及cDNA反转录

每个阶段的日本无针乌贼胚胎各取6颗，于研钵中加液氮充分碾磨，每个胚胎转移100 mg粉末于1.5 mL离心管中，采用RNAiso Plus (TaKaRa, 日本)试剂盒提取总RNA，提取方法依据说明书进行操作。经微量核酸测定仪(NanodropTMOne, Thermo ScientificTM, 美国)及凝胶电泳测定RNA质量浓度及纯度后，使用反转录试剂盒 (Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit, Roche,瑞士)对RNA进行反转录，反转录方法依据说明书进行操作，反转录后cDNA置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.3 引物设计

根据已构建的日本无针乌贼转录组测序及注释信息[18]，结合美国国立生物技术信息中心数据库中已报道的软体动物基因组序列，采用Primer Premier 5.0软件对six3、eya、pax6、gapdh(内参)、rpl23a(内参)基因进行引物设计，由通用生物公司设计合成，引物序列见表1。

1.4 荧光定量PCR

以提取到的8个阶段乌贼样品的cDNA(与转录组取样一致，每个胚胎取100 mg)作为模板(n=6)，以gapdh和rpl23a作为内参基因，使用PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Foster, USA)，通过BioRad公司的荧光定量PCR仪(CFX96 Touch, California, USA) 对six3、eya、pax6基因在不同阶段的乌贼胚胎中的相对表达水平进行检测。反应程序为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40 个循环; 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s。每个样品及内参均设置 2个平行，采用GraphPad Prism 7软件对数据进行处理，并根据Ct值，用2-ΔΔCt法对结果进行分析。

表1 试验用引物序列

1.5 统计分析

对获得的荧光定量结果采用SPSS 23软件进行统计分析，差异显著水平检验采用单因素方差分析，*表示差异显著，其中，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2 结果与分析

2.1 日本无针乌贼胚胎发育过程

根据日本无针乌贼胚胎发育特征(图1)，及基因表达分析研究，将日本无针乌贼胚胎发育划分为3个时期[受精卵—眼原基形成期(SJ1)、功能器官分化期(SJ2)、幼体孵化期(SJ3)]、8个阶段[受精卵—胚芽原基及胚体形成(SJ1-1)，口、漏斗原基出现(SJ2-2)，眼点形成(SJ2-3)，红眼(SJ2-4)，墨囊形成(SJ2-5)，黑眼(SJ2-6)，内壳形成(SJ2-7)，刚孵化幼体(SJ3-8)](表2)。

图1 日本无针乌贼胚胎发育过程特征观察Fig.1 Observation of the developmental characteristics of embryos in Japanese spineless cuttlefish S. japonicaa～b.受精卵—眼原基形成期(SJ1-1); c～h.功能器官分化期(c.SJ2-2; d.SJ2-3; e.SJ2-4; f.SJ2-5; g.SJ2-6; h.SJ2-7); i.幼体孵化期 (SJ3-8)；放大倍数10×.a—b.fertilized egg-eye primordium formation period (SJ1-1); c—h.functional organ differentiation period (c.SJ2-2; d.SJ2-3; e.SJ2-4; f.SJ2-5; g.SJ2-6; h.SJ2-7); i.larval incubation period (SJ3-8)；magnification 10×.

表2 日本无针乌贼胚胎发育过程

2.2 日本无针乌贼胚胎不同发育阶段six3、eya、pax6基因表达分析

基因表达分析结果表明，以gapdh、rpl23a为内参，six3、eya基因表达量均随乌贼胚胎发育从受精卵—眼原基形成期到幼体孵化期3个时期8个阶段逐渐增加；six3基因在幼体孵化期第8阶段相对表达量相比受精卵—眼原基形成期第1阶段及功能器官分化期6个阶段均显著增加，功能器官分化期第7阶段相比受精卵—眼原基形成期第1阶段及功能器官分化期第2、3阶段均显著增加；eya基因在幼体孵化期第8阶段相对表达量相比受精卵—眼原基形成期第1阶段及功能器官分化期第2阶段显著增加，功能器官分化期第7阶段相比受精卵—眼原基形成期第1阶段显著增加。pax6基因相对表达量随乌贼胚胎发育从受精卵—眼原基形成期到功能器官分化期有所增加，但从功能器官分化期第2阶段开始直至幼体孵化期第8阶段基因表达量逐渐降低；以gapdh基因为内参，pax6基因在幼体孵化期第8阶段相对表达量相比受精卵—眼原基形成期第1阶段及功能器官分化期第2～6阶段显著降低，而以rpl23a基因为内参，3期相对表达量无显著差异(图2)。

图2 日本无针乌贼不同胚胎发育阶段six3、eya及pax6基因相对表达量(n=6)Fig.2 The relative transcript levels of six3，eya，and pax6 genes in different embryonic developmental stages of Japanese spineless cuttlefish S. japonica a～b.six3基因； c～d.eya基因； e～f.pax6基因； 图中数值为平均值±标准差；*.P<0.05， **.P<0.01.a—b.six3 gene； c—d.eya gene； e—f.pax6 gene； values are expressed as the mean±SD； *.P<0.05， **.P<0.01.

3 讨 论

3.1 six3、eya及pax6基因在日本无针乌贼胚胎发育期中的表达量

本项目组日本无针乌贼转录组数据库[18]使用短reads组装软件Trinity组装拼接后获得58 054条Unigene，这些Unigene中，作为研究对象的six3基因，其Unigene长度为1220 nt，GC含量为48.61%；eya基因，其Unigene长度为4194 nt，GC含量为39.96%；pax6基因，其Unigene长度为1036 nt，GC含量为37.45%。根据每百万Reads中来自某一基因每千碱基长度的Reads数目(RKPM)值计算，six3基因在3个时期中的表达RPKM均值为1.06；eya基因在3个时期中的RPKM均值为0.99；pax6基因在3个时期中的RPKM均值为0.40。根据高原等[24]对RPKM值划分定义基因表达高低的方法，将基因表达量分为以下4个水平：中高表达量RPKM(30～+∞)、偏低表达量RPKM(3～30)、低表达量RPKM(1～3)、超低表达量RPKM(0～1)。本试验中，日本无针乌贼胚胎eya基因及pax6基因在3个时期RPKM均值均在超低表达量RPKM(0～1)的区间中，即eya、pax6基因在胚胎发育3个时期的表达量均为超低表达量，six3基因在3个时期RPKM均值在低表达量RPKM(1～3)的区间中，即six3基因在胚胎发育3个时期的表达量均为低表达量，因此推测six3、eya、pax6 3个基因在基因转录控制网络中以较低表达量进行调节作用，如six3以较低表达量调节视网膜发育，而过表达则可引起某些特定细胞亚群的扩增[25-29]。

3.2 双内参基因gapdh、rpl23a在six3、eya及pax6基因表达分析中的应用

根据Pfaffl等[30-31]基因稳定性测量方法，本试验在基因表达分析中，采用双内参基因gapdh、rpl23a对数据进行归一化处理。在six3、eya基因表达分析中，以gapdh及以rpl23a为内参基因结果一致，内参基因受候选基因表达强度影响较小，而在pax6基因表达分析中，以rpl23a为内参基因，所分析各时期样品的表达水平变化较以gapdh为内参基因各时期样品的表达水平变化大，但无显著性差异出现，表达趋势一致。目前有关日本无针乌贼基因表达分析内参基因选择报道较少，该结果有助于日本无针乌贼基因表达分析选择稳定的参考基因。

3.3 six3、eya及pax基因在日本无针乌贼眼睛发育中的调控作用

脊椎动物眼形态的发生受到包括six、eya及pax在内的几个重要基因的调控，它们在脊椎动物和果蝇的视网膜前体细胞分化及增殖，光感受器神经元细胞的维护中起着关键作用[32]。Koenig等[33]研究显示，与脊椎动物一样，头足类动物中six3及eya基因参与晶状体的形成，头足类动物中six3及eya基因在胚胎发育早期眼区(如胚胎的眼基、视叶)及在胚胎发育后期胚基板和盖的边缘可观察到有明显表达。本试验中，six3、eya基因在日本无针乌贼不同胚胎发育时期及阶段的相对表达量结果显示，six3、eya基因在眼原基形成期有微量表达，并随胚胎发育，从眼原基形成期到幼体孵化期8个阶段相对表达量逐渐显著增加，表明six3、eya在日本无针乌贼眼睛发育中同样起重要作用。

在脊椎动物胚胎发育期，pax6基因在视网膜发育后期的腺管和神经节细胞中表达[34]。在鱿鱼胚胎发育期，pax6基因被认为是眼形成通用主控基因，参与光感器官的发育，pax6基因在加州鱿鱼(Loligoopalescens)眼睛发育过程中的表达方式与果蝇无眼基因表达方式类似，无眼基因在果蝇眼盘未分化前体细胞中表达活跃，在眼盘后端形成形态沟后的分化细胞中表达明显下降，pax6基因在加州鱿鱼光区外胚层和中胚层表达明显，而在分化的视网膜细胞中无表达[35]。本试验中，pax6基因在日本无针乌贼胚胎发育功能器官分化期表达量增加，在眼点形成前期眼柄突出时表达最活跃，随胚胎发育视网膜细胞分化表达逐渐降低，与加州鱿鱼中pax6基因表达相似，而pax6基因在日本无针乌贼眼睛发育后期调控与脊椎动物不同[36]。

3.4 six3、eya、pax6基因在基因转录控制网络调控网络中的调节作用

six3、eya、pax6基因在日本无针乌贼眼原基形成期、功能器官分化期及幼体孵化期3个胚胎发育时期8个阶段不同程度的表达水平表明，这3个基因在基因转录控制网络中发挥不同调节作用。有研究表明，eya基因表达的EYA蛋白是一类重要的转录调控因子，其在胚胎发育过程中对组织和器官的特异性分化具有重要调控作用[37-38]，EYA蛋白可以与SIX蛋白发生直接相互作用[39-40]，作为SIX蛋白的共激活因子激活SIX[41]，因而推测基因功能关联性可能与six3、eya基因相对表达量均从眼原基形成期到幼体孵化期逐渐显著增加相关。头足类动物中，pax6基因调节基因转录控制网络上游[36]，同时，有研究表明，在哺乳动物眼睛晶状体诱导和分化过程中，six3为pax6的下游调控基因，激活了pax6等相关基因的表达[42-43]，而在日本无针乌贼胚胎发育中，pax6基因也在较早时期(眼原基形成期至功能器官分化期)相对表达量较高，基因相对表达量在功能分化基本完成后(幼体孵化期)显著降低。

笔者仅对日本无针乌贼胚胎不同发育阶段3个眼部相关基因进行了分析研究，有关不同发育阶段眼部组织学特征及不同发育阶段眼部不同部位这3个基因的表达有待进一步分析。

4 结 论

根据日本无针乌贼胚胎3个发育时期转录组数据，发现eya、pax6基因在3个发育时期均为超低表达量基因，six3基因在3个发育时期为低表达量基因。3个基因在日本无针乌贼胚胎3个发育时期8个阶段的相对表达量变化表明其在基因转录控制网络中发挥不同调节作用。日本无针乌贼胚胎眼部发育过程所涉及的基因转录控制网络机制尚未查明，笔者从胚胎3个发育时期转录组数据库中寻找与胚胎生长发育，器官功能分化等相关基因进行分析，并对每一阶段的基因变化进行研究探讨，为构建基因转录控制网络，了解调控机制提供数据支持，同时也为日本无针乌贼胚胎的人工繁育和增养殖提供有效的数据参照。