长链非编码RNA LINC00460在非小细胞肺癌中的表达及作用机制

丁梦杰 张旭东 胡俊霞

作为临床实践中最常见的恶性肿瘤，85%的肺癌为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[1]。 非小细胞肺癌患者主要类型为腺癌，大细胞癌及鳞状细胞癌[2]。 由于非小细胞肺癌患者的临床症状体征不明显，大多数患者初次入院确诊时处于晚期治疗阶段。现阶段，随着医学卫生事业的进步与完善，肺癌分子生物学也在不停的发展，新药不断被研制应用，然而晚期非小细胞肺癌患者的5年生存率仍然只有15%[3-5]。 故积极寻找治疗非小细胞肺癌患者的新方法，探索有用的治疗靶点，是目前国内外临床研究的热门话题。相关研究[6-7]指出，长链非编码RNAs的异常表达可能与人类疾病关联，在肿瘤出现、增殖、侵入、迁移、耐药和复发等过程中起着重要调节作用，可能成为癌症治疗的新靶点。目前，已经阐明了一些LncRNA在肿瘤发生机制中的作用，例如位于HOXC 12q13.13的HOTAIR对乳腺癌有重要影响[8]。 相较而言，关于lncRNA在人类肺癌分子生物学机制中的研究很少。本文检测了lncRNA LINC00460在NSCLC患者癌组织与癌旁组织中的表达情况，旨在分析lncRNA LINC00460与患者临床因素的关系及长链非编码RNA LINC00460在非小细胞肺癌预后中的作用。

1 材料与方法

1.1 一般资料

使用回顾性调查法，选取2018年3月至2019年在我院收治的90例非小细胞肺癌患者作为研究对象，根据lncRNA LINC00460在癌细胞组织中的表达水平，将高表达水平患者(≥8.45)设为观察组(56例)，低表达水平患者(<8.45)设为对照组(34例)。观察组男性39例，女性为17例，年龄为34～80岁，平均年龄为(57.48±8.72)岁。对照组男性21例，女性13例，年龄为32～81岁，平均年龄为(56.14±9.33)岁。2组患者均同意并接受手术治疗。2组患者的临床资料存在可比性(P>0.05)。本研究征得我院伦理委员会的批准同意。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准[9]：①所有患者经手术治疗，病理结果确诊为原发性非小细胞肺癌；②术前未接受放化疗及其他辅助治疗；③患者无精神障碍，依从性良好，能够配合。

排除标准[10]：①心肝肾等器官功能障碍，存在血液性疾病，急性感染，药物过敏史；②合并其他恶性肿瘤；③临床资料不全或中途退出者。

1.3 实验与方法

1.3.1 试剂与仪器 由南京诺唯赞生物工程有限公合成lncRNA LINC00460引物；使用购自ABI公司的逆转录试剂盒与RNA提取试剂盒；使用购自TaKaRa公司STBR Premix Ex Taq试剂盒；使用购自ABI公司；紫外分光光度计购自赛默飞公司实时动态定量聚合酶链反应(qPCR)仪。

1.3.2 研究方法 (1)总RNA提取：通过超声处理使50 mg样品组织均质化，根据RNA提取试剂盒的说明从组织中提取总RNA。(2)逆转录反应：1 μmol/l逆转录特异性引物3 μl，10×RT缓冲液1.5 μl 100 mmol/l dNTP0.1 5 μl，50 U/μl MultiScribeTM逆转录酶1.0 μl，20 U/μl RNase抑制剂0.19 μl，总RNA 1 μl，用DEPC水补至20 μl。 作用条件：在25 ℃反应10 min，在37 ℃反应60 min，在85 ℃反应5 min，在4 ℃下储存使用。(3)qPCR扩增：严格按照STBR Premix Ex Taq试剂盒操作说明书进行操作。 5'-ACAGCATGAGCCAGGA-CATC-3'为lncRNA LINC00460上游引物，5'-GAAAGCTGCAACAT-GCTCCC-3'为下游引物。 将以下试剂加入冰中：1 μl逆转录产物cDNA，1 μl引物，10 μl TaqManGEx MASTER Mix和20 μl双蒸水。 作用条件：在95 ℃下预变性5 min，95 ℃15 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，总共40个循环。(4)数据处理：以GAPDH为内参，2-ΔΔCt值(lncRNA LINC00460)-2-ΔΔCt值(GAPDH)为lncRNA LINC00460相对表达水平。

1.4 统计学方法

本组研究数据经整合后均采用 SPSS20.0 版进行处理分析，计数资料数据用百分比(%)表示，用卡方或 Fisher 确切概率法进行检验；计量资料数据用表示，组间比较用t检验，使用Cox多元素回归模型分析 lncRNA 与非小细胞肺癌患者临床预后的关系，数据对比差异显著且存在统计学意义用P<0.05 表示。

2 结果

2.1 lncRNA LINC00460在非小细胞肺癌患者癌旁组织与癌组织中的表达水平

RT-qPCR检测结果显示，90例非小细胞肺癌患者中癌旁组织lncRNA LINC00460 的相对表达均值为(1.58±0.86)，低于癌组织的(8.54±3.05)，差异有统计学意义(t=20.836，P<0.05)。

2.2 非小细胞肺癌患者临床病理特征与lncRNA LINC00460表达的关系

2组患者的癌组织中lncRNA LINC00460表达水平在性别、年龄、病理分型、肿瘤直径及血管侵犯方面进行对比，差异无统计学意义(P>0.05)；但2组患者的癌组织中lncRNA LINC00460表达水平在分化程度与有无发生淋巴结转移方面的差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 非小细胞肺癌患者临床病理特征与lncRNA LINC00460表达的关系/例

2.3 lncRNA LINC00460的表达与非小细胞肺癌患者预后的关系

观察组56例患者lncRNA LINC00460平均表达水平为(5.63±1.96)；对照组34例患者lncRNA LINC00460平均表达水平为(10.17±3.14)。观察组与对照组的无进展生存率分别为(9.4±1.2)月与(18.9±2.1)月，2组对比差异存在统计学意义(P<0.05)。观察组与对照组的总生存期分别为(14.7±2.1)月和(22.7±1.6)月，2组对比差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 LINC00460的表达与非小细胞肺癌患者预后的关系月)

2.4 非小细胞肺癌患者总生存期cox 回归分析

单因素COX分析显示，男性、肿瘤直径、血管侵犯、淋巴结转移、LINC00460高表达是非小细胞肺癌患者总生存期的危险因素。多因素 COX 回归模型显示lncRNA LINC00460 高表达水平患者与非小细胞肺癌患者的总生存期(HR = 2.31，95% CI：1.76 ～3.69，P= 0.013)相关，是其独立预后影响因子，男性、肿瘤直径、血管侵犯及淋巴结转移是非小细胞肺癌患者总生存期的独立危险因素，见表3。

表3 非小细胞肺癌患者总生存期cox 回归分析

3 讨论

近年来，肺癌的发病率与死亡率居高不下，由于缺少高效的初始生物标志物，早期临床检测率低，患者出现身体不适就诊时处于晚期阶段[11]。多数研究人员着手研究非小细胞肺癌患者的发病机制，但其机制尚未完全了解，治疗效果不佳。 已有资料[12]报道，lncRNA在各种肿瘤的病理生理过程中发挥重要作用。目前，探索非小细胞肺癌患者的发病机制和治疗方式已成为研究的热点[13-14]。RNA测序及lncRNAs微阵列等技术的发展和使用让更多的非小细胞肺癌患者失调的lncRNA被发现[15-17]。以癌基因或肿瘤抑制基因参与癌症进展，lncRNAs是非小细胞肺癌患者诊断和临床预后的治疗靶点及重要生物标志物[18-19]。

作为非编码RNA，lncRNA不仅影响蛋白质，还可以影响细胞自身的各种过程，例如细胞分化、细胞生长，剂量校正、DNA损伤与染色体印迹。MR-NA和miRNA结合形成复合物，导致lncRNA的二级和三级结构，其调节基因转录，蛋白质翻译过程和mRNA稳定结构，现阶段，尚未有精确的机制[20-23]。lncRNA LINC01296介入肺癌的发展可能与特定信号转导通路中重要蛋白的转录或修饰相关。相关研究[24]指出，lncRNA LINC01296可能与PI3K-Akt-mTOR通路存在关联，这是癌症有关的主通路之一，在癌症进展中发挥重大作用。在本研究的早期阶段，lncRNALINC00460在非小细胞肺癌癌组织中的表达明显高于癌旁组织，本文RT-qPCR结果显示非小细胞肺癌患者癌组织中lncRNA LINC00460的表达量高于癌旁组织(P<0.05)，与之前报道的基因芯片的结果相一致[25]。此外，本研究追踪了观察组和对照组患者无进展生存期及总生存期，结果显示观察组和对照组患者无进展生存期分别为(9.4±1.2)月和(18.9±2.1)月，总生存期分别为(14.7±2.1)月和(22.7±1.6)月，差异均有统计学意义(P<0.05)。表明了lncRNALINC00460表达上调可能和患者预后不良关联。 lncRNALINC00460表达下调一定程度上可改善患者临床预后并延长生存期。

本研究对lncRNA LINC00460表达与非小细胞肺癌患者组织中患者病理学特征进行分析，发现，不同性别、年龄、病理分型、肿瘤直径及血管侵犯的非小细胞肺癌患者癌组织中lncRNA LINC00460相对表达对比差异不存统计学意义(P>0.05)，然而不同病理分级的lncRNALINC00460相对表达与淋巴结转移的存在与否有显着性差异(P<0.05)。这表明非小细胞肺癌患者的病情恶化程度及lncRNA LINC00460的表达水平正相关，lncRNA LINC00460可能介入了非小细胞肺癌患者的进展，因此下调lncRNA LINC00460表达是临床治疗的新思路。

在多变量COX回归分析中，lncRNALINC01296的高表达水平，男性，肿瘤直径，血管侵犯和淋巴结转移是非小细胞肺癌患者预后不良的独立预测因子。但该研究未收集有关术后接受放化疗者的信息，可能对结果造成一定误差。后期将扩大样本量，完善信息收集，进一步研究lncRNALINC01296对非小细胞肺癌患者的临床意义及作用机制。

综上所述，lncRNA LINC00460的表达在非小细胞肺癌患者的癌组织中上调，且影响非小细胞肺癌患者预后，是非小细胞肺癌预后的独立预测因子。