HIF-1α、MITF、CRP、NLR在乙型肝炎病毒感染相关性肝癌中的表达及其意义

张小芳 刘志良 蔡 勇 黄传生 罗庆丰

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)占原发性肝癌的90%以上，而我国是乙肝大国，多数肝癌患者合并乙型肝炎病毒。HIF-1α体内分布广泛，经证实与多种肿瘤的发生发展相关，且已经成为肿瘤研究和治疗的靶点[1]。中性粒细胞与淋巴细胞比值(neutrophil to lymphocyte ratio，NLR)作为炎症因子的典型代表，是许多恶性肿瘤的研究热点[2]，它们与HBV感染相关性肝癌是否有关，目前研究少有报道。本文通过比较MITF、HIF-1α、CRP及NLR在HBV感染与非感染相关性肝癌中水平差异，初步探讨HBV感染相关性HCC的发病机制并寻找其治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集我院2016年9月至2018年3月我院初诊初治的原发性肝细胞性肝癌患者97例，平均年龄61岁，男性60例、女性37例，根据是否感染HPV分为感染组62例、未感染组35例。所有石蜡包埋组织标本均于常温下10%中性缓冲福尔马林溶液4～5倍于标本体积中固定12～24 h。患者均为初治，术前均未接受过放疗或化疗等治疗。所有术后标本经规范取材后，切片均经由两位高年资经验丰富的病理医师按照2015年版《原发性肝癌规范化病理诊断指南》明确诊断，并按Edmondson分级系统按高、中、低分化并完成免疫组化的判读。同时收集患者相关临床病理信息。

1.2 HIF-1α及MITF检测

收集我院收治的肝癌患者97例手术标本，每隔1 cm连续切开；常温下10%中性缓冲福尔马林溶液4～5倍于标本体积，固定12～24 h，按“7点”基线取材方案取材。 采用Envsion二步法，同时设立阳性对照组并将以上组织包埋、切片、脱水，3%过氧化氢室温孵育10 min，蒸馏水冲洗3次共9 min，高压锅抗原修复，滴加一抗HIF-1α多克隆抗体(美国)/MITF多克隆抗体(中杉)，37 ℃孵育4 h，PBS冲洗3次，滴加二抗工作液(均为福建迈新)，37 ℃孵育30 min，PBS在组织边缘反复冲洗3次，DBA染色15 min，冲洗，复染，脱水，透明，人工封片后镜下观察。

1.3 HIF-1及MITF结果判定

HIF-1α信号以细胞质内出现棕黄微细颗粒视为阳性，MITF信号以细胞核内出现棕黄微细颗粒视为阳性。根据肿瘤细胞阳性比例和着色强度综合制定免疫组化半定量标准阳性细胞记分：每例均随机观察3个高倍镜视野，取平均值。用半定量积分法判断结果，每个视野计数100个细胞，阳性细胞≤ 5%为0分，>5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，阳性细胞> 75%为4分；阳性强度黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。两者积分相乘，0分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8分为中度阳性(++)，9～12分为强阳性(+++)。免疫组织化学染色结果的判读由2位病理学专家独立评判，最后达成共识。

1.4 C反应蛋白的检测方法

采集所有患者不抗凝的空腹肘部静脉血各3 ml，静置2 h，经3 000 r/min，离心20 min分离血清(离心半径16 cm)，取血清置于Eppendorf管内冷冻存于-20 ℃保存待检。实验步骤、结果判断及质量控制方法按厂家说明。CRP≥8.2 mg/l判为阳性，测定线性范围为(0.3～150.0)mg/l。

1.5 NLR的检测

于术前1天，清晨采集患者的空腹静脉血行血常规检查，并将血常规中的中性粒细胞数值除以淋巴细胞数值计算得到NLR的比值。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 MITF在HCC中的表达

通过反复实验观察发现MITF在肝细胞性肝癌组织中无表达。

2.2 HIF-1α、CRP在HCC中的表达

HIF-1α在HBV感染组中高表达且高于无HBV感染相关组(卡方值为11.37，P<0.05)，且具有统计学意义。CRP值在2组中高表达，但差异没有统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 HBV感染组和未感染组HIF-1α、CRP表达情况(例，%)

2.3 NLR在HPV感染组和未感染组中的比较

NLR在HBV感染组中为3.03±1.84，在HBV未感染组中为2.42±1.83，2组比较无统计学意义(t=0.073，P>0.05)。

3 讨论

我国是肝癌大国，其中病因与患者感染乙肝病毒多年相关，因此本文选择以HBV感染相关的HCC为观察对象进行研究，可能更符合我国国情及实际的临床工作。目前，肝癌的治疗主要是以手术为主，而中晚期特别是合并HBV感染的患者，因多合并肝硬化且肝功能不佳，多不能耐受手术，故治疗效果不佳，死亡率高。因此积极探讨肝癌的可能致病机制及治疗靶点意义深远。

缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)最初是由 Semenza 在 1991 年发现的，是1种氧依赖的转录激活因子，由 HIF-1α和 HIF-1β 2个亚基组成的异二聚体转录因子，其中HIF-1α分子大小约为 120 kD，是氧敏感亚基，低氧条件下可被诱导表达并累积[1，3-4]。HIF-1α调控多种基因的转录，如调节糖酵解、促进肿瘤细胞增殖、迁移和血管生成[5]，由于其在恶性肿瘤细胞中的特异性表达和HIF在体内的广泛分布，HIF-1α基因正日益成为肿瘤治疗研究领域关注的热点课题之一。文献中HIF-1α在HBV感染相关性肝癌中的研究较少。通过本课题研究观察，HIF-1α在HBV感染相关性肝癌中表达明显高于没有合并HBV感染的HCC组，这可能与病毒感染导致的细胞代谢改变，加重细胞缺氧，进而导致疾病的进展相关。如果能有效地抑制HIF-1a的表达，逆转肿瘤缺氧过程导致的促进肿瘤发生的或可能为肝癌治疗带来新的机遇。另外，有研究发现MITF可转录激活HIF-1α而促进肿瘤血管生成[6]。本课题组经反复实验证实，尽管MITF可能在部分肝癌细胞培养的细胞系中表达，但是在肝癌的组织中却未见理想的表达，因此肝癌中HIF-1a的激活可能与MITF的关系不大。

CRP是机体受到微生物入侵或组织损伤等炎症性刺激时肝细胞合成的急性相蛋白，是临床上常用的急性时相反映指标，后被证实在多数肿瘤患者的血清中呈高水平表达，其浓度与肿瘤的侵袭和患者的生存率有关[7]。肿瘤患者血清CRP水平的升高很可能是继发于肿瘤坏死、局部组织损伤及炎症的一个反应。CRP的检测对恶性疾病的评估有重要的临床价值。NLR可能是反映全身炎症状态的良好指标，与肝细胞癌大小、TNM分期、门静脉癌栓和AST等临床病理指标相关，同时NLR是肝细胞癌肝切除术患者总体生存的独立预后因素[8-11]。HBV感染相关性HCC中CRP、NLR的表达情况如何，目前文献报道的较少。本实验通过观察CRP、NLR在HBV相关性肝癌中表达情况来了解该类型肝癌的特点，结果发现感染HPV组中CRP、NLR均明显高于未感染HPV组，但差异无统计学意义。

综上所述，HBV感染相关性HCC机制可能与乏氧相关，与炎症反应有一定的相关性。针对HBV感染相关性HCC的治疗可以更多地关注抑制乏氧过程，兼顾抑制肿瘤发生中的炎症反应过程。本研究还有许多不足之处，继续寻找调控HBV感染相关的HCC发病机制中的关键因子和分子靶点将是肝癌治疗的关键。