雷公藤甲素对恶性黑色素瘤A375细胞EMT通路及侵袭相关蛋白表达的影响

王艳云 高明敏 姚 丽 张永红

恶性黑色素瘤是恶性程度极高的皮肤恶性肿瘤[1-3]，具有高死亡率，而且侵袭性也较高，是目前引起男性死亡的第5大恶性肿瘤，是引起女性死亡的第6大恶性肿瘤，其发病机制较为复杂，目前仍然未完全研究清楚。中药雷公藤为卫矛科，雷公藤属木质滕本植物，从中分离提取的有效物质已达数百种，如雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤多甙等，已经研究证实具有抗炎、抗肿瘤等多种生物活性[4-6]。雷公藤甲素是中药雷公藤中分离出的活性最高的环氧化二萜内酯化合物，也是雷公藤抗肿瘤药效的主要成分。上皮-间质转化(EMT)是指有极性的上皮细胞转化为具有移行能力的间质细胞的过程，在转化过程中细胞获得了侵袭和转移能力，研究显示[7-8]，EMT通路是恶性肿瘤侵袭和转移的途径之一。为此，本研究对雷公藤甲素对恶性黑色素瘤A375细胞EMT通路及侵袭相关蛋白表达的影响进行了研究，现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

人恶性黑色素瘤细胞株A375细胞来源于北京中科院科研中心，雷公藤甲素来源于上海源叶生物科技有限公司，CCK-8来源于美国 Sigma公司，人抗鼠波形蛋白(Vimentin)抗体来源于美国 Santa Cruz公司，兔抗人缺氧诱导因子(HIF-1α)抗体、N-钙黏素(N-cadherin)抗体来源于美国 CST 公司，胰蛋白酶来源于美国 Hyclone 公司，Matrigel 基质胶来源于美国 BD 公司，Transwell 小室来源于美国Corning 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养方法 将冷冻储存的A375细胞复苏后置于含有10%FBS的完全培养基中进行培养，培养条件：温度37 ℃，5%CO2的恒温细胞孵育箱内孵育培养。每间隔24h换培养液1次，在显微镜下观察到培养的细胞已在培养基内布满80%面积后加入0.25%胰蛋白酶消化，后在离心机内以3 000 r/min转速、4 ℃温度条件下离心，然后按照1∶2进行传代培养，2～3 d传代1次，本研究所培养细胞均为对数生长期细胞。

1.2.2 A375细胞增殖状态 采用 CCK-8 法检测A375细胞增殖状态。将培养好的A375细胞接种于96孔板，5 000个/孔，培养12 h后观察到细胞贴壁，取0 mg/l、20 mg/l、40mg/l、60 mg/l浓度的雷公藤甲素母液分别加入上述培养孔板，每组5个复孔，分别对应空白对照组、20 mg/l组、40 mg/l组、60 mg/l组，然后在温度37 ℃，5%CO2的恒温细胞孵育箱内继续孵育培养24 h，再每孔加入浓度为5 g/l、20 μl剂量的CCK-8，再孵育4 h，吸除掉培养液，再加入150 μl的 DMSO，震荡10 min，促使晶体充分溶解，然后用波长为570的酶联仪对每孔的吸光度值(OD)进行测定，计算出细胞生长抑制率。

1.2.3 A375细胞侵袭能力的测定方法 采取细胞侵袭实验检测，Matrigel细胞依据雷公藤甲素浓度进行分组，Matrigel细胞在4 ℃下过夜，用RPMI 1640培养液稀释并后包被Transwell上室，成胶体，然后加入培养的A375细胞于上室，在下室内加入5%的血清培养液，再培养24 h，然后将未穿透微孔滤膜的细胞用无菌棉签擦试干净，固定，结晶紫染色，蒸馏水冲洗，显微镜下观察迁移细胞数并且计数。

1.2.4 EMT通路及侵袭相关蛋白表达 以Western Blot方法检测EMT相关蛋白水平。A375细胞根据前述方法培养传代，培养之贴壁，吸除培养液，并且加入上述不同浓度的雷公藤甲素液，每组为6孔，在培养24 h后取出并且PBS清洗3遍，再加入细胞裂解液，后进行离心处理，以BCA法计算蛋白浓度，然后加入6×Loading buffer 上样缓冲液沸水煮沸5 min 变性，取提取的蛋白用 SDS-PAGE凝胶进行分离和转膜、温室封闭等处理，最后加入目标一抗蛋白，在4 ℃下孵育过夜，隔日进行TBST洗膜后加入目标蛋白二抗然后在25 ℃下孵育1 h，再次TBST洗膜，最后ECL法显影后对目标蛋白表达水平以内参蛋白β-actin标准化后得到相对比值。采用 Image Lab 软件测定分析表达量。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 不同浓度雷公藤甲素对A375细胞增殖能力的影响

不同浓度的雷公藤甲素对A375细胞进行处理后细胞存活率明显不同，比较差异有统计学意义(F=73.492，P<0.05)。雷公藤甲素对A375细胞的增殖能力在20 mg/l时已经出现抑制，因此后续实验均选择此浓度，随着雷公藤甲素浓度增加细胞存活率明显下降，雷公藤甲素对A375细胞增殖的抑制具有浓度依赖性，见表1。

2.2 不同浓度雷公藤甲素对A375细胞侵袭能力的影响

不同浓度的雷公藤甲素对A375细胞进行处理后侵袭细胞数量明显不同，比较差异有统计学意义(F=185.86，P<0.05)。随着雷公藤甲素浓度增加侵袭细胞数量随之下降，雷公藤甲素对A375细胞侵袭能力的抑制具有浓度依赖性，见表1。

表1 不同浓度雷公藤甲素对A375细胞存活率、侵袭能力的影响

2.3 不同浓度雷公藤甲素对A375细胞HIF-1α及EMT通路相关侵袭蛋白表达的影响

不同浓度的雷公藤甲素对A375细胞进行处理后HIF-1α及Vimentin、N-cadherin的表达量比较差异有统计学意义(F=32.19、24.88、52.49，P均<0.05)。随着雷公藤甲素浓度的增加，HIF-1α及Vimentin、N-cadherin的表达量随之下降，见表2。

表2 不同浓度雷公藤甲素对A375细胞HIF-1α及Vimentin、N-cadherin的表达的影响

3 讨论

恶性肿瘤的侵袭和转移是导致患者病情不断进展的主要原因，EMT信号通路是恶性肿瘤侵袭和转移的途径之一[7-8]，在此过程中上皮细胞向间质转化，引起细胞基因和形态的改变，EMT信号通路主要包括撕裂原活化蛋白激酶信号通路、转化生长因子β信号通路、Wnt/beta-catnin信号通路、NF-kB信号通路、Notch信号通路等[7-10]。肿瘤的低氧或者缺氧环境有助于大多数恶性肿瘤细胞的增殖和侵袭，HIF-1α是EMT信号通路的主要调控因子，通过结合缺氧反应元件调控靶基因的合成，最终影响到细胞的凋亡、转移和侵袭等多个方面[11-13]。恶性肿瘤患者往往表现为HIF-1α的表达上调，同时，HIF-1α也能作为患者预后及病情严重程度的评价指标。Vimentin、N-cadherin均为EMT信号通路相关蛋白，Vimentin基因位于染色体的10p13，属于Ⅲ型中间纤维蛋白，Vimentin是EMT信号通路中的主要标志物，EMT发生时Vimentin会出现高度表达，Vimentin在恶性肿瘤的转移、侵袭中均有重要意义，同时相关研究显示Vimentin的表达下调后能抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力[14-16]。N-cadherin是依靠结合钙离子粘附糖蛋白，属于间质标志物，主要在内皮细胞和神经等间质组织中分布，能调节钙离子介导的细胞间的粘附、细胞形态的维持和极性、细胞的迁移及识别等，在EMT信号通路中与Vimentin的作用相似，能介导肿瘤细胞从上皮细胞向间质细胞转化，促使血管生成、肿瘤侵袭和迁移[17-19]。

恶性黑色素瘤是皮肤恶性肿瘤，近年来恶性黑色素瘤的发病率逐年升高，治疗主要以手术切除为主，辅助以放化疗等其他措施，但是患者生存率仍然较低。随着现代医学的快速发展，中药在恶性肿瘤的治疗中越来越受到重视，而且大量的研究显示[20-22]，中药很多有抗炎、抗肿瘤、改善免疫功能等作用。中药雷公藤也被应用在恶性黑色素瘤患者的治疗中。研究显示，雷公藤甲素具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节、抗菌等功效，在治疗恶性肿瘤时能与化疗药物共同作用起到杀伤肿瘤细胞的作用，同时还能抑制肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，其抗肿瘤时可通过抑制肿瘤细胞增殖、降低细胞侵袭和转移能力、诱导细胞凋亡等多种途径发挥作用[16,22-24]。

本研究对雷公藤甲素对恶性黑色素瘤A375细胞EMT通路及侵袭相关蛋白表达的影响进行了研究，对恶性黑色素瘤A375细胞进行体外培养，加入雷公藤甲素对A375细胞的增殖、侵袭能力等进行了实验研究，结果显示雷公藤甲素在体外不仅能抑制A375细胞的增殖，还同时能抑制其侵袭能力，同时观察到随着雷公藤甲素浓度增加细胞存活率、侵袭细胞数量明显下降，表明雷公藤甲素对A375细胞增殖和侵袭能力的抑制具有浓度依赖性，雷公藤甲素抑制A375细胞的增殖和侵袭能力是肯定的。同时，观察不同浓度的雷公藤甲素对A375细胞进行处理后HIF-1α及Vimentin、N-cadherin的表达量，随着雷公藤甲素浓度的增加，HIF-1α及Vimentin、N-cadherin的表达量随之下降，推测明雷公藤甲素可能主要是通过抑制EMT信号通路及其相关蛋白的表达进而起到抑制肿瘤细胞增殖和侵袭的作用，但是在此途径中有无其他途径共同作用，尚需要进行其他实验进一步深入研究。

综上所述，雷公藤甲素能抑制恶性黑色素瘤A375细胞中HIF-1α及Vimentin、N-cadherin表达，通过抑制EMT通路抑制恶性黑色素瘤细胞的增殖及侵袭，且雷公藤甲素对恶性黑色素瘤A375细胞的增殖和侵袭抑制具有浓度依赖性，但是由于雷公藤甲素也有一定毒副作用，因此尚需要后期进一步研究其抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭的最佳浓度，为日后临床应用雷公藤甲素治疗恶性黑色素瘤提供更为安全有效的依据。