NLRP3基于IL-1β/TGF-β信号通路对心力衰竭小鼠室性心律失常易感性的调控机制研究

范群雄，段兴刚，王磊，张涛

心力衰竭简称心衰，是一种由各种原因引起心脏结构或心脏舒张、收缩功能异常而导致的心脏循环障碍症候群，其发病率约0.9%，出院后3年病死率约30%，出院后5年病死率约60%[1]。室性心律失常是心衰常见并发症之一，为心衰患者死亡的重要原因[2]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）是一种位于细胞内的蛋白质复合体，能够识别应激相关内源性信号分子和多种病原微生物，在炎症联级反应、固有免疫、动脉粥样硬化、心肌细胞凋亡、心肌纤维化等过程中具有重要作用[3]。当炎症反应发生时，机体NLRP3大量释放，其下游的炎性因子白细胞介素1β（IL-1β）和转化生长因子β（TGF-β）表达水平亦会发生变化[4]。研究显示[5]，以NLRP3炎性小体为中心的IL-1β/TGF-β信号通路在心肌缺血再灌注损伤过程中具有重要作用。研究报道[6]，NLRP3与心衰后心律失常有关，但其机制是否与IL-1β/TGF-β信号通路有关尚待研究。为此，本研究分析了NLRP3基于IL-1β/TGF-β信号通路对心衰小鼠室性心律失常易感性的调控机制，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SD小鼠39只，清洁级，雄性，周龄6～8周，体质量（200±20）g，购于上海睿智化学研究有限公司，许可证号：SYXK（沪）2019-0029。

1.2 动物分组、心衰小鼠造模及干预SD小鼠随机分为对照组、模型组、干预组，每组各13只。模型组、干预组腹腔注射异丙肾上腺素（3 mg/kg，上海禾丰制药有限公司），2/d，连续4周；对照组腹腔注射等量0.9%生理盐水，2/d，连续4周。成功复制心衰小鼠模型后，干预组腹腔注射1 μl NLRP3 shRNA慢病毒载体（浓度2×106/μl，山东维真生物科技有限公司），模型组腹腔注射1 μl 0.9%生理盐水（武汉巴菲尔生物技术服务有限公司）。超声显示射血分数（EF）≤45%为心衰小鼠造模成功[7]。

1.3 评价项目造模成功后，继续饲养4周评价以下指标。记录各组小鼠一般情况：包括小鼠精神、被毛、进食、活动量、体温、呼吸、体重等情况。采集外周静脉血2 ml，采用XL90超速低温离心机（上海实维实验仪器技术有限公司），3000 r/min离心15 min，分离血清，采用酶联免疫吸附法（ELISA），利用Bio-Tek ELX800酶标仪（北京泰泽嘉业科技发展有限公司）和相关试剂盒（上海晶抗生物工程有限公司）检测血清脑钠肽（BNP）水平。麻醉小鼠，沿食管将一长约20 cm起搏电极插入，鼻尖至心搏最强处的距离为插入长度，进行12 V恒压交流电击18 s，2/d，连续3 d，第一次电击后待大鼠心律恢复正常进行二次电击。室性心律失常诱发3 d后，各组小鼠在麻醉状态下行右侧颈总动脉插管（将连接压力换能器的插管经右侧颈总动脉逆行插入左心室），通过PowerLab生物信号采集与分析系统（上海埃德仪器国际贸易有限公司），测定并记录左室舒张末压（LVEDP）、左室收缩末压（LVESP）。处死小鼠，剪下心脏，取心尖部心肌，PBS溶液冲洗，4%多聚甲醛溶液（北京索莱宝科技有限公司）固定，梯度酒精（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）脱水，二甲苯（合肥博美生物科技有限责任公司）透明，石蜡包埋成块，切成5 μm连续切片，脱蜡水化，采用HE染色试剂盒（武汉百浩天生物科技有限公司）染色，流水冲洗，烘片0.5 h，脱水，透明，中性树胶固封剂（上海邦景实业有限公司）封片，在MDS400光学显微镜（重庆奥特光学显微镜有限公司）下观察心肌形态学变化。

1.4 统计学方法采用SPSS 22.0软件进行数据分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间两两比较采用SNK-Q检验，多组间比较采用单因素方差分析；计数资料采用例数（构成比）表示，多组间计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况对照组小鼠精神、毛发、进食、活动量、体温、呼吸、体重等情况均正常；模型组小鼠出现明显心衰体征，即精神萎靡、被毛松软、光泽度差、脱毛、蜷缩少动、行动迟缓、捕捉反抗减少、进食减少、呼吸加快、体重增长缓慢、体温下降等；干预组心衰体征表现较模型组有所改善。

2.2 各组小鼠心肌病理变化对照组小鼠心肌结构和形态正常，心肌细胞横纹清晰，无肿胀、变性、坏死，心肌纤维排列有序，心肌间质未见明显炎性细胞浸润；模型组小鼠心肌细胞肥大，横纹模糊，心肌组织间可见大量炎性细胞浸润，结缔组织及胶原纤维明显增加；干预组小鼠心肌结构和形态趋于正常，横纹较清晰，心肌细胞稍肿胀，结缔组织及胶原纤维减少，组织间少量炎性细胞浸润（图1）。

图1 各组小鼠心肌病理变化（HE染色×400；A：对照组；B：模型组；C：干预组）

2.3 各组小鼠心功能指标及室性心律失常诱发率对比模型组小鼠LVESP、LVEDP、血清BNP水平较对照组高（Q=6.994、11.258、35.502，P均＜0.05）；干预组小鼠LVESP、LVEDP、血清BNP水平较对照组高（Q=3.419、6.853、25.110，P均＜0.05）；干预组小鼠LVESP、LVEDP、血清BNP水平较模型组低（Q=3.575、4.405、10.392，P均＜0.05）；模型组小鼠室性心律失常诱发率较对照组高（χ2=12.461，P＜0.001）；干预组小鼠室性心律失常诱发率较对照组高（χ2=2.889，P=0.089）；干预组小鼠室性心律失常诱发率较模型组低（χ2=4.248，P=0.039），表1。

表1 各组小鼠心功能指标及室性心律失常诱发率对比

2.4 各组小鼠心肌组织中NLRP3、IL-1β、TGF-β蛋白表达量比较模型组小鼠心肌组织中NLRP3、IL-1β、TGF-β蛋白表达量较对照组高（Q=6.643、7.918、7.929，P均＜0.05）；干预组小鼠心肌组织中NLRP3、IL-1β、TGF-β蛋白表达量较对照组高（Q=5.536、4.131、4.142，P均＜0.05），但干预组小鼠心肌组织中NLRP3、IL-1β、TGF-β蛋白表达量较模型组低（Q=12.179、3.796、3.787，P均＜0.05），表2。

表2 各组小鼠心肌组织中NLRP3、IL-1β、TGF-β蛋白表达量对比

3 讨论

心力衰竭是一种复杂的临床症状群，以组织血液灌注不足、体循环淤血为主要病理变化，以呼吸困难、体力活动受限、体液潴留为主要临床表现，为心肌炎、高血压性心脏病、高脂血症、冠心病、急性心肌梗死（AMI）等心血管疾病（CVD）发展的终末阶段[8]。其发病诱因繁多，病理机制复杂，涉及心脏负荷过度增加、炎症损伤、心室重构、内分泌异常等[9]。因猝死而死亡的心衰患者约占总病死的40%～60%，其中多与心律失常有关，特别是室性心律失常[10]，因此，研究心力衰竭后室性心律失常的发病机制具有重要临床指导意义。

NLRP3是一种大分子多蛋白复合体，分子量约700 Kda，分布于细胞内。NLRP3也是重要的炎症反应调控因子，能与接头蛋白ASC、半胱氨酸天冬氨酸酶-1结合形成炎性复合体，从而促进经典炎症因子IL-1β活化，调控促纤维化因子TGF-β表达。NLRP3活化与K+外流、细胞内Ca2+浓度、组织蛋白酶释放、活性氧族形成关系密切[11]。NLRP3在自身炎性反应、动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤等病理过程中具有重要作用[12]。研究显示，活化后的NLRP3可通过促进IL-1β、IL-18合成，引起下游的炎症反应。文献报道[14]，NLRP3可介导心肌细胞的炎症联级反应，且能够诱导心肌细胞凋亡和心肌纤维化。研究显示[15]，以NLRP3炎性小体为中心的IL-1β/TGF-β信号通路在心肌缺血再灌注损伤、心衰、心律失常、心室重构等病理过程中具有重要作用。本研究中，模型组小鼠出现明显心衰体征，心肌细胞肥大，心肌间质可见大量炎性细胞浸润，结缔组织及胶原纤维明显增加，干预组小鼠心衰体征及心肌病理变化较模型组有所改善，提示下调NLRP3表达能够改善心衰小鼠心衰体征及心肌病理变化。此外，模型组小鼠LVESP、LVEDP、血清BNP水平、室性心律失常诱发率较对照组显著升高，干预组小鼠LVESP、LVEDP、血清BNP水平、室性心律失常诱发率较模型组显著下降，提示下调NLRP3表达能够改善心功能及降低室性心律失常易感性。此外，模型组小鼠心肌组织中NLRP3、IL-1β、TGF-β蛋白表达量较对照组显著升高，干预组小鼠心肌组织中NLRP3、IL-1β、TGF-β蛋白表达量较模型组显著下降，提示NLRP3、IL-1β、TGF-β在心衰小鼠中呈现高度激活状态，而下调NLRP3水平后，IL-1β、TGF-β水平亦明显下降，因此，下调NLRP3表达后心衰小鼠心衰体征及心肌病理变化改善、心功能改善、室性心律失常易感性降低可能与IL-1β/TGF-β信号通路受阻有关。分析得出，心衰时炎症因子如IL-1β大量分泌，心肌发生持续的炎症反应，促纤维化因子如TGF-β1大量释放，使心肌成纤维细胞活化，引起心肌组织纤维化，而成纤维细胞又能分泌促炎因子，促进炎症细胞向心肌转移，从而形成恶性循环；此外，心肌组织中的炎症细胞也可直接分泌炎症介质来促进心肌纤维化，心肌纤维化后会造成心肌细胞排列不规整，结构形态异常，心肌局部传导异常，这种传导异常会增加心律失常发生率。

综上所述，NLRP3可能通过激活IL-1β/TGF-β信号通路而增加心力衰竭小鼠室性心律失常易感性，为临床用药提供新的方向。但本研究属于小样本研究，数据结果可能存在偏倚，尚待进一步考证。