C-Kit、父系表达基因10在原发性肝癌患者中的表达及与临床特征和预后的关系

张晓虎，裴旭东，闪海霞，朱喜增

南阳市中心医院感染科，河南 南阳 473001

原发性肝癌（primary liver cancer，PLC）是指发生于肝细胞或肝内胆管细胞的恶性肿瘤，是中国常见的恶性肿瘤之一。据调查显示，近年来中国PLC的发病率呈逐渐上升且年轻化趋势。由于PLC早期无典型症状，患者常在中晚期出现肝区持续性疼痛、肝大、黄疸、肝功能减退、门脉高压综合征等，若不及时治疗，将对患者的生命安全造成严重威胁。目前，早期诊断和评估PLC患者病情并采取治疗措施是提高PLC诊疗率的关键。相关研究发现，恶性肿瘤的发生与遗传印记相关基因及原癌基因密切相关。因此，PLC的早期诊断及早期治疗可从分子水平研究入手。C-Kit作为重要的细胞原癌基因，是酪氨酸激酶受体蛋白家族的一员，参与造血干细胞的分化、增殖，与胃肠间质瘤及其他肿瘤密切相关，印记基因父系表达基因10（paternally expressed gene 10，PEG10）具有高度的组织特异性，随着肿瘤分化程度的增加，其表达水平升高，已被证实与肿瘤进展具有相关性。但目前临床上关于PEG10基因与PLC的相关性尚未见明确报道。本研究探讨了C-Kit和PEG10蛋白在PLC患者中的表达及与临床特征和预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年2月至2017年2月南阳市中心医院收治的接受肝穿刺治疗且经病理组织检查确诊的PLC患者。纳入标准：均经肝穿刺治疗且术后病理学检查确诊为PLC。排除标准：合并心、肝、肾、肺疾病；术后随访资料不完整。依据纳入和排除标准，本研究共纳入90例患者。其中，女44例，男46例；年龄32～76岁，平均（56.06±6.32）岁；临床分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期23例，Ⅲ期21例，Ⅳ期19例；组织学类型：肝细胞癌48例，胆管细胞癌42例。收集PLC患者的PLC组织90例及癌旁正常组织90例。

1.2 免疫组织化学染色法检测C-Kit和PEG10蛋白表达

采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（streptavidin-perosidase，SP）检测PLC组织和癌旁正常组织中C-Kit和PEG10蛋白的表达情况。将石蜡包埋的组织标本连续2 μm切片，60℃烘烤，二甲苯脱蜡，浸泡3次，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）洗涤3次；滴加内源性过氧化物酶阻断剂，室温孵育15 min，PBS冲洗；滴加一抗（C-Kit或PEG10多克隆抗体，浓度为1∶100），室温孵育1 h，PBS冲洗。滴加辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠/兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）聚合物，室温孵育30 min；滴加山羊抗兔二抗，室温孵育30 min；二氨基联苯胺显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。采用PBS代替一抗作为对照。

1.3 免疫组织化学染色结果判断

随机选择每张切片的5个视野，根据染色强度和视野中阳性细胞比例进行评分。依据染色强度评分：无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；依据阳性细胞比例评分：＜25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。染色强度评分与阳性细胞比例评分相乘，0～1分为阴性（-），2～4分为弱阳性（+），5～8分为中等阳性（++），9～12分为强阳性（+++）。其中，阴性（-）和弱阳性（+）为低表达，中等阳性（++）和强阳性（+++）为高表达。

1.4 观察指标及随访

记录患者的临床资料，包括年龄、性别、临床分期、组织分化程度、甲胎蛋白（α-fetoprotein，AFP）水平、组织学类型、预后评分。采用格拉斯哥昏迷评分法（Glasgow coma scale，GCS）根据患者睁眼、语言、肢体运动等进行预后评分，总分为15分，评分越高，提示意识状态越好。记录C-Kit和PEG10蛋白表达情况及预后情况。比较PLC组织和癌旁正常组织中C-Kit和PEG10蛋白的表达情况，比较不同临床特征PLC患者PLC组织中C-Kit和PEG10蛋白的表达情况。所有患者治疗结束后均随访3年，随访截止时间为2020年2月29日，随访率为100%。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 PLC 组织和癌旁正常组织中C-Kit和PEG10蛋白表达情况的比较

PLC组织中C-Kit蛋白的高表达率为75.56%（68/90），明显高于癌旁正常组织的13.33%（12/90），差异有统计学意义（χ=70.560，P＜0.01）；PLC组织中PEG10蛋白的高表达率为81.11%（73/90），明显高于癌旁正常组织的8.89%（8/90），差异有统计学意义（χ=94.837，P＜0.01）。（表1、表2）

表1 PLC组织和癌旁正常组织中C-Kit蛋白的表达情况

表2 PLC组织和癌旁正常组织中PEG10蛋白的表达情况

2.2 不同临床特征PLC患者PLC组织中C-Kit和PEG10蛋白表达情况的比较

不同年龄、性别、组织学类型的PLC患者PLC组织中C-Kit和PEG10蛋白表达情况比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）。临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、低分化、AFP水平＞200 ng/ml的PLC患者PLC组织中C-Kit蛋白高表达率分别明显高于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、AFP水平≤200 ng/ml的患者，差异均有统计学意义（

χ

=14.739、10.222、10.458，

P

＜0.01）；临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、低分化、AFP水平＞200 ng/ml的PLC患者PLC组织中PEG10蛋白高表达率分别明显高于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、AFP水平≤200 ng/ml的患者，差异均有统计学意义（

χ

=12.622、7.626、8.506，

P

＜0.01）。（表3）

表3 不同临床特征PLC患者PLC组织中C-Kit和PEG10蛋白的表达情况（n=90）

2.3 预后情况

3年随访结束后，90例PLC患者的3年生存率为51.11%（46/90）。

2.4 PLC 患者预后影响因素的单因素分析

不同年龄、性别PLC患者的3年生存率比较，差异均无统计学意义（

P

＞0.05）。临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、低分化、预后评分＜7分、C-Kit蛋白高表达、PEG10蛋白高表达、AFP水平＞200 ng/ml的PLC患者的3年生存率分别明显低于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、预后评分≥7分、C-Kit蛋白低表达、PEG10蛋白低表达、AFP水平≤200 ng/ml的患者，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。（表4）

表4 PLC患者预后影响因素的单因素分析（n=90）

2.5 PLC 患者预后影响因素的多因素分析

多因素Logistic回归分析结果显示，临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、低分化、预后评分＜7分、C-Kit蛋白高表达和PEG10蛋白高表达均是PLC患者预后的独立危险因素（

P

＜0.05）。（表5）

表5 PLC患者预后影响因素的多因素分析（n= 90）

3 讨论

据流行病学统计，全球消化系统恶性肿瘤中肝癌的病死率居第3位，中国作为肝癌的高发区，肝癌死亡例数占全球总死亡例数的46%左右。因此，对PLC的早期诊断、治疗及相关分子生物学研究一直是临床研究热点。

随着生物学研究的不断深入，有学者发现相关蛋白改变在PLC的发生发展中具有重要作用，且与PLC的预后相关。本研究结果显示，PLC组织中C-Kit和PEG10蛋白的高表达率均明显高于癌旁正常组织，且临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、低分化、AFP水平＞200 ng/ml的PLC患者PLC组织中C-Kit和PEG10蛋白高表达率分别明显高于临床分期为Ⅰ～Ⅱ期、中高分化、AFP水平≤200 ng/ml的患者。说明PLC的发生和发展与C-Kit和PEG10蛋白有着密切联系。PEG10是一种新发现的遗传印记相关基因，研究发现，与p53、p16、c-myc等肿瘤相关基因比较，PEG10具有更高的肝癌组织特异性，其具有作为新的肝癌早期诊断标志物的潜力。有学者采用免疫组织化学染色法检测肝癌中PEG10蛋白表达，结果发现，肝癌组织中PEG10蛋白表达水平明显高于癌旁正常组织，且随着肝癌分化程度的降低，其表达增加，与本研究结果一致。C-Kit基因是HZ4猫科肉瘤病毒kit癌基因的同源物，位于人染色体4q12-13。C-Kit是白色斑点显性基因的等位基因，属于原癌基因，其产物是Ⅲ型酪氨酸激酶，编码145 kD的跨膜糖蛋白——酪氨酸激酶受体，后者即为C-Kit受体。周芳颖等研究显示，C-Kit基因突变可刺激肿瘤细胞的持续性增殖和抗凋亡信号的失控，有利于肿瘤的恶性克隆。相关研究发现，几乎所有的Cajal细胞都表达C-Kit，黑色素瘤、生殖细胞及造血细胞中也有C-Kit表达。由此可知C-Kit与PLC具有相关性，与本研究结论一致。

本研究结果还显示，临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、低分化、预后评分＜7分、C-Kit蛋白高表达和PEG10蛋白高表达均是PLC患者预后的独立危险因素（P＜0.05）。考虑原因如下：随着肿瘤临床分期的升高，患者病情加重，导致预后情况较差；组织分化程度较低时，肝癌细胞的分化能力增强，恶性程度增高，导致患者的预后较差；作为判断预后的预后评分可在一定程度上反映病情严重程度，预后评分越低，说明患者病情越重，其生存率及预后均会受到影响。

综上所述，C-Kit和PEG10在PLC组织中高表达，其表达情况与患者的临床特征及预后有关，临床分期为Ⅲ～Ⅳ期、低分化、预后评分＜7分、C-Kit蛋白高表达和PEG10蛋白高表达均是PLC患者预后的独立危险因素，C-Kit和PEG10蛋白可作为理想的PLC预后标志物。