来曲唑对香猪睾丸波形蛋白表达的影响

陈力力，田兴贵*，张爱琼

（1.贵州大学动物科学学院，贵州贵阳 550025；2.毕节市动物疫病预防控制中心，贵州毕节 551700）

雌激素在精子的产生、成熟和受精中起重要作用，进而影响雄性动物的生殖能力[1]。来曲唑（Letrozole）是新一代芳香化酶抑制剂，它能降低猪内源性雌激素的生成且不影响促性腺激素的分泌[2]，进而影响猪睾丸的生长发育[3]。有研究表明，波形蛋白在维持精子生成、修复生精管上皮损伤以及恢复精子生成中起重要作用[4]；波形蛋白细胞骨架改变与内皮细胞凋亡存在相关性[5]；波形蛋白不仅在正常的细胞中表达，在乳腺癌细胞中也有表达，且与细胞的迁移和侵袭相关[6]，表明波形蛋白与细胞黏附、迁移、生长、凋亡以及睾丸细胞数和精子产生密切相关。但雌激素是否通过影响波形蛋白的表达进而影响香猪睾丸细胞的生长发育有待研究。因此，本研究拟通过来曲唑降低香猪体内雌激素含量来研究其对睾丸生精小管细胞中波形蛋白表达及分布的影响，从而进一步了解雌激素对睾丸细胞生长发育的作用。

1 材料与方法

1.1 试验设计及饲养管理 香猪由贵阳市乌当区绿生源畜牧科技公司香猪生态福利养殖场提供。选取4 头体质健康母猪所分娩的12 头14 日龄雄性香猪，每头母猪有3 头雄性猪仔，猪仔平均体重3 kg，随机将每头母猪所分娩的雄性小香猪分为3 组，在相同条件下分开饲养母猪及其小猪，即饲养温度、湿度、光照与环境一致，每天清扫圈舍，定时投喂饲料，自由饮水。

1.2 药物及试剂 来曲唑为Sigma 公司产品；波形蛋白抗体（批号为GR3230520-3）和SP（小鼠 ΙgG）-POD（批号为ΝO.20181009）为Abcam 公司产品。

1.3 药物投喂 对照组不做任何处理；2 个试验组分别经口投喂0.1 mg/kg 和0.2 mg/kg 来曲唑（投喂剂量参考文献[2]，并稍作修改，即本试验在其0.1 mg/kg 来曲唑剂量组的基础上，增加了 0.2 mg/kg 来曲唑剂量组），每3 d 投喂1 次，连续投喂15 次，在最后一次投喂7 d后经外科手术无菌取出左侧睾丸。

1.4 睾丸组织石蜡切片制作 将经外科手术取出的无菌新鲜左侧睾丸横切后放入4%多聚甲醛中固定24 h，经70%酒精20 min，80%、95%、95%、100%、100%酒精各30 min 处理进行脱水，用二甲苯处理2 次，每次5 min进行透明，随后在石蜡中浸泡2 次，每次30 min，从浸蜡盒中将其取出放入正方体小盒子底部，向其中倒入液态石蜡，室温冷却凝固，进行包埋，制成组织蜡块。待石蜡固定后将猪睾丸组织蜡块取出晾干、修块，放在旋转式切片机上固定好，调整好角度后均匀的切成5 μm厚的连续切片，用镊子或蘸水牛角针挑起单个的蜡片带，放入40℃温水中自然展平，用经酸浸泡、清洗、酒精浸泡、防脱剂处理过的载玻片轻轻捞起，并垂直放入载玻片架子中，将其放在37℃恒温箱中烘烤过夜。每隔5张取1 张切片做免疫组织化学检测。

1.5 免疫组织化学检测 将做好的切片染色后进行免疫组织化学检测。首先将切片从烤箱中取出，室温放置30 min，把切片放入二甲苯Ι 5 min、二甲苯ΙΙ 5 min、100%酒精Ι 2 min、100%酒精ΙΙ 2 min、95%酒精2 min、80%酒精2 min、70%酒精2 min、蒸馏水5 min 中进行脱蜡与水化处理；随后将切片平铺于湿盒内，每张切片加10 μL 3%过氧化氢，室温下孵育1 h 后拿出，放入载玻架中，用PBS（pH7.4）冲洗3 遍，每次3 min，对内源性过氧化物酶灭活；其次将切片放入装有柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）的烧杯中，用微波炉将其缓冲液加热直至沸腾，关掉电源，间隔5～10 min，反复1～2 次，冷却后PBS（pH7.4）冲洗2 遍，每次3 min，对抗原进行修复；接着将切片平铺于湿盒内，每张切片加10 μL 正常血清工作液，在室温下孵育1 h，倾去上清，勿洗，对非特异性抗原进行封闭，然后将波形蛋白抗体用稀释液按1:70 的比列稀释，每张切片加10 μL，放入冰箱4℃过夜，进行一抗孵育，一抗孵育结束后将切片平铺于湿盒内，将羊抗小鼠ΙgG 浓缩液用稀释液按1:100稀释成工作液，每张切片加10 μL，室温孵育1 h，将切片拿出放入载玻架中，用PBS（pH7.4）冲洗3 遍，每次2 min，紧接着将切片平铺于湿盒内，将链霉亲和素浓缩液用稀释液按1:100 稀释成工作液，每张切片加10 μL，室温孵育1 h，将切片拿出放入载玻架中，用PBS（pH7.4）冲洗3 遍，每次2 min。最后，将切片平铺于湿盒内，将PBS（pH 7.4）按1 mL PBS 加入50 μL 20×DAB 显色液A、50 μL 20×DAB 显色液B，充分混合后，每张切片加10 μL，室温显色，光学显微镜下控制时间，一般5～10 min，将切片拿出放入载玻架中，蒸馏水洗涤终止反应，随即将切片经苏木素染色3 min、蒸馏水5 min、70% 酒精2 min、80% 酒精2 min、95%酒精2 min、100% 酒精Ι 2 min、100% 酒精ΙΙ 2 min、二甲苯Ι 5 min、二甲苯ΙΙ 5 min 进行苏木素复染处理，待干燥后中性树脂封片镜检。

1.6 显微镜检与细胞计数 在Νikon 80i 光学显微镜40倍物镜下计数每张睾丸组织切片上的6 个正圆形生精小管中睾丸细胞总数和睾丸生精小管细胞波形蛋白的阳性细胞数，同时进行组织切片拍照。计数睾丸生精小管内细胞总数、波形蛋白表达阳性细胞总数以及波形蛋白在睾丸生精小管细胞部分细胞质和整个细胞质表达阳性细胞数。总阳性率为波形蛋白表达阳性细胞总数与睾丸生精小管内细胞总数的百分比，部分细胞质表达阳性率为波形蛋白在睾丸生精小管细胞部分细胞质表达阳性细胞数与睾丸生精小管内细胞总数的百分比；整个细胞质表达阳性率为波形蛋白在睾丸生精小管细胞整个细胞质表达阳性细胞数与睾丸生精小管内细胞总数的百分比。

1.7 统计分析 利用SPSS 22.0 统计软件，独立样本t检验，统计结果以平均值± 标准误表示，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 免疫组织化学测定结果 如图1 所示，波形蛋白在香猪睾丸生精小管细胞胞质中表达，且在睾丸生精小管细胞基底部围绕其细胞核成环状，随着其胞质的延伸呈放射状伸向睾丸生精小管管腔，随着来曲唑剂量的增加，波形蛋白表达增强，向管腔的放射状加长；且波形蛋白在睾丸生精小管细胞内染色部分存在差异，呈现出2 种情况，即细胞质部分区域表达以及整个细胞质都有表达。

图1 免疫组织化学检测来曲唑对香猪睾丸生精小管细胞波形蛋白的影响

2.2 显微镜检与细胞计数结果 在显微镜下观察波形蛋白在睾丸生精小管细胞胞浆中表达，细胞质染成棕黄色。由表1 可知，与对照组相比，0.1 mg/kg 组和0.2 mg/kg组香猪睾丸生精小管细胞总数减少（P＜0.01），但香猪睾丸生精小管细胞中表达波形蛋白细胞比率上升（P＜0.01）；且0.2 mg/kg 组睾丸生精小管波形蛋白在睾丸生精小管细胞部分细胞质表达阳性率均高于0.1 mg/kg组（P＜0.01）；随着来曲唑剂量的增加，波形蛋白在睾丸生精小管细胞整个细胞质表达阳性率呈先上升再下降趋势（P＜0.01）。总的来说，随着来曲唑剂量的增加香猪睾丸生精小管细胞中表达波形蛋白细胞比率极显著上升。

表1 来曲唑对香猪睾丸生精小管细胞总数及波形蛋白表达阳性率的影响

3 讨论

波形蛋白在睾丸支持细胞和间质细胞中构成其细胞骨架成分，对于维持支持细胞的稳定性及完整性具有重要作用，它主要分布在血液、骨骼、腹膜和睾丸等中胚层来源的组织中[7]。采用免疫组织化学方法研究显示波形蛋白在新生犊牛睾丸生精管、直细精管、睾丸网和小管间组织中分布，且主要定位于支持细胞核周位置[8]，在豪猪睾丸支持细胞和间质细胞中均有波形蛋白表达[9]。本研究发现，波形蛋白在香猪睾丸生精小管细胞胞质中也有表达。Tsutsumi 等[10]将芳香化酶抑制剂注入雄性大鼠体内，发现大鼠睾丸生殖细胞退化和附睾内梭形精子细胞数显著减少。本实验室前期发现经口投喂来曲唑后幼年香猪睾丸生精小管内细胞总数减少[11]，而在经腹腔注射一定剂量己烯雌酚（0.3、3 mg/kg）后能促使睾丸生殖细胞数显著增多，而使睾丸支持细胞数量显著减少[12]；最新资料显示，来曲唑通过降低山羊睾丸中雌二醇含量影响其生长和繁殖能力[13]，因此笔者推测来曲唑通过降低内源性雌激素来影响香猪睾丸细胞的生长发育，且主要导致生殖细胞凋亡和支持细胞增加。同时，本实验室前期研究发现香猪睾丸支持细胞的增殖主要发生在1 月龄前[14]，说明经来曲唑作用后香猪睾丸支持细胞的增殖期可能延长。

研究表明，波形蛋白在损伤生精上皮的修复与恢复精子产生有关，这是由于波形蛋白在控制细胞生长与分化中起重要作用[4]，同时波形蛋白表达减少会导致精子产生受损，当波形蛋白的分布发生改变会引起生精细胞凋亡增加[15]，波形蛋白在猪睾丸细胞中表达并与睾丸的生长发育有关[16]。邓茂先等[17]研究发现，环境雌激素双酚A 通过抑制基因转录干扰波形蛋白合成，从而影响支持细胞骨架的正常形成，导致细胞形态改变；任军慧等[18]研究发现，青春期大鼠受己烯雌酚（DES）持续作用后，成年时睾丸支持细胞和间质区的波形蛋白表达量显著下降，且损伤呈剂量效应关系。这些结果说明波形蛋白在睾丸细胞的生长发育过程中起重要作用，其可能是通过调节睾丸细胞的骨架成分来发挥作用。本研究中投喂来曲唑后波形蛋白在香猪睾丸生精小管细胞部分表达阳性率上升，表明来曲唑可通过降低香猪体内雌激素含量，促进波形蛋白的表达，进而影响睾丸生精小管细胞的生长发育。

4 结论

综上所述，来曲唑降低香猪体内雌激素水平后会导致睾丸生精小管内细胞总数减少，使香猪睾丸生精小管细胞波形蛋白阳性表达率增加，说明来曲唑可能促进香猪睾丸生精小管细胞中波形蛋白的表达，进而影响睾丸生精小管支持细胞与生殖细胞的生长和分化成熟过程，但其作用机制需进一步研究。