不同解冻程序对荣昌猪冷冻精液解冻效果的影响

甘麦邻，刘 麟，赵 雪，郑 婷，郭宗义，沈林園，潘红梅，张 亮，王金勇*，朱 砺*

（1.四川农业大学动物科技学院，四川成都 611130；2.四川农业大学畜禽遗传资源发掘与创新利用四川省重点实验室，四川成都 611130；3.重庆市畜牧科学院，重庆 402460）

动物人工授精技术可以极大提升优秀种公畜的利用效率和利用空间，故被称作家畜繁殖领域的第一次革命，而精液冷冻技术则可以突破时空限制进一步放大优秀种公畜的影响[1]。牛、羊等少数畜种精液冷冻技术较为成熟，已经得到大范围推广和应用，而猪的精子脂质含量高，质膜结构特殊，导致猪精子的抗冻性较差，精液冷冻后存活率低、冻精配种受胎率低，在商业生产中的应用受到限制[2]。当前，猪应用冷冻精液进行人工授精的比例不足1%[3]。

冷冻精液除了面临冷冻过程的低温打击，还要面临解冻过程的复苏伤害[4]。猪精液冷冻和复苏过程同样经历了“固态——液态”2 种形态的转变，因此猪冷冻精液的解冻过程与猪精液冷冻过程非常重要[8]。长期以来，研究人员将主要精力集中于降低精子冷冻过程的低温打击[5]，并开发出了一系列降低精子低温打击的方法[6]和相关冷冻保护剂[7]，对猪冷冻精液的解冻研究相对缺乏。荣昌猪是世界八大优良猪种之一，主产于重庆荣昌和四川隆昌两地，具有早熟、耐粗饲、适应性强、性情温驯和肉品质好等特点，是我国地方品种中西南型的主要代表猪种之一。本实验旨在研究不同解冻液、不同解冻温度和时间对荣昌猪冷冻精液解冻效果的影响，使用因子分析法评估和筛选不同解冻液适用的最佳解冻程序，以期为荣昌猪资源保护和推广利用相关研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料 如无特殊说明，所用试剂均购自索莱宝科技有限公司（北京），精液为健康荣昌猪的0.25 mL细管冷冻精液。

1.2 解冻液配制 商业解冻液M（Androhep® CryoGuard Thaw Extender，Mintub，德国）按说明书进行配制。自配解冻液J 和C 为四川农业大学猪遗传育种团队结合前期研究和查阅文献的基础上自行配制[8]，配方见表1。

表1 自配解冻液配方 g

1.3 解冻方法 将冻精细管从液氮中取出后迅速放入提前预热的恒温水浴锅（32、37、42、47、52℃），按下计时键（记10 s 或20 s），并缓慢搅动水浴，待计时器报警，立即从水浴中取出冻精细管，用干净的纸巾擦干细管。剪开细管的两端，使解冻融化的精液自行流入干净容器，按1:9 的比例将冻融精液与解冻液混合。从冻融精液与解冻液混合时开始计算冻精解冻后的保存时间。将与解冻液冻混合的冻融精液分为2 份，1 份置于37℃水浴中孵育，待测。另1 份放入17℃恒温箱保存24 h 后检测。

1.4 精子指标检测 使用前在37℃载物台对计数板进行预热，将解冻后的精液样品缓慢注入计数待检计数室，使之均匀流入整个计数室，再在显微镜下观察并使用精子自动分析系统（AndroVision，Minitube，德国）分析精子活率、活力快速前进运动精子数、慢速运动精子数等指标。

1.5 最适解冻温度和时间筛选 分别于精液解冻后3、6、9、12、15、18、21、24、30 min 及1、24 h 检测精子在不同条件（32℃ 20 s；37℃ 10 s；37℃ 20 s；42℃10 s；42℃ 20 s；47℃ 10 s；47℃ 20 s 和52℃ 10 s）下解冻后精子的冻后活力、活率、快速前进运动精子率和慢速前进运动精子比率。为便于因子分析结果的描述，将冷冻精液解冻后的最高活率所对应的精子活力、快速前进运动精子和慢速解冻精子定义为即时精子指标，将解冻后17℃保存24 h 的精子活率和活力记为精子保存指标，记录10 个不同解冻时间对应高于40%活率数、活力高于30%数，记为精子持续指标。

1.6 因子分析步骤 ①收集和处理数据；②计算相关系数矩阵；③使用主成分分析法提取因子，计算分析特征值1 的主成分贡献率；④采用正交旋转法获得成分得分系数矩阵；⑤利用成分得分系数矩阵求得各主成分得分；⑥进一步使用特征值1 的主成分的总体贡献率百分比作为权重计算综合得分。

1.7 统计分析 使用WPS office 进行数据初步处理和整理，使用SPSS 20.0 软件进行因子分析筛选不同解冻液对应的最适解冻温度和时间。

2 结果与分析

2.1 解冻液M 对精子冻后质量的影响 如图1 所示，解冻液M 对不同解冻温度和解冻时间解冻的精子活率和活力均呈缓慢下降，快速前进运动精子呈快速下降趋势，而慢速运动精子数随解冻时间延长基本维持。3 个条件下（37℃ 10 s；42℃ 20 s；47℃ 10 s）解冻的精子置于17℃保存24 h，仍有高于30% 的活率。此外，本研究所设各种解冻温度以10 s 或20 s 解冻后，各项检测指标无典型的随温度或时间变化而变化的趋势。

图1 解冻液M 不同解冻温度和时间对解冻后精子活率的影响

2.2 解冻液J 不同解冻温度和时间对精子指标的影响如图2 所示，使用解冻液J 进行解冻时，不同解冻温度和解冻时间条件下解冻的精液每项检测指标的结果也表明解冻后的精子指标无典型随解冻温度或解冻时间变化而变化的特征。使用解冻液J 进行解冻时不同解冻温度和解冻时间程序解冻的精子活率、活力和快速运动精子数均呈现缓慢先上升后下降的变化趋势，慢速运动精子数在解冻后30 min 内基本维持在相近水平。

图2 解冻液J 不同解冻温度和时间对解冻后精子活率的影响

2.3 解冻液C 不同解冻温度和时间对精子指标的影响如图3 所示，使用解冻液C 进行解冻时，与解冻液M和J 类似，以不同程序解冻的精子，其冻后精子的每项检测指标也无典型随解冻温度或解冻时间变化而变化的特征。使用解冻液C 进行解冻后的精子各项检测指标随时间变化与解冻液M 相似，而不同于解冻液J。此外，慢速运动精子数在30 min 内呈缓慢增加趋势。

图3 解冻液C 不同解冻温度和时间对解冻后精子活率的影响

2.4 3 种解冻液对解冻后精子指标的影响 从图4 中可以看出，解冻液M 解冻后的精子活率和精子活力曲线可与解冻液M 和C 分离，显示出更好的效果。此外解冻液C 解冻后随时间推移精子活率、活力和快速前进运动精子下降速度快于解冻液M 和J。

图4 不同解冻液不同解冻温度和时间对解冻后精子活率的影响

2.5 不同解冻液最适解冻温度和时间筛选 从旋转成分矩阵（表2）可以看出，解冻液M 第1 主成分主要反映保存指标和持续指标（47℃ 10 s 最高），第2 主成分主要反映即时指标（47℃ 20 s 最高），第3 主成分主要反映慢速前进运动精子（37℃ 20 s 最高）；解冻液J 第1 主成分主要反映即时指标和持续指标（32℃ 20 s最高），第2 主成分主要反映保存指标（42℃ 10 s 最高）；解冻液C 第1 主成分主要反映持续指标（32℃20 s 最高），第2 主成分主要反映即时指标（52℃ 10 s最高），第3 主成分主要反映活力和快速前进运动精子（52℃ 10 s 最高）。计算综合得分，显示解冻液M 和J 最适解冻方式为42℃ 20 s；解冻液C 最适解冻方式为32℃ 20 s。利用因子分析计算得到的最适解冻温度和时间，则解冻后的精子指标在3 种解冻液中差距进一步缩小（图6）。

图6 不同解冻液不同解冻温度和时间对解冻后精子活率的影响

表2 不同解冻液不同解冻温度和时间旋转成分矩阵

图5 不同解冻液不同解冻温度和时间对应综合指数

3 讨论

3.1 不同解冻液对荣昌猪精液冷冻后解冻效果的影响使用合适的方法和手段使猪精子在液氮中固态保存时存活固然重要，而使液氮中存活的精子成功复苏也非常重要。解冻液成分不同是影响解冻效果的主要因素之一。本研究发现，3 种不同解冻液在相同的解冻程序下，最高解冻活率之间相差8.17%，最高解冻活力相差7.13%。

冷冻精液目前主要有低温缓慢解冻（5℃）、室温中速解冻（15℃）、体温快速解冻（37～40℃）以及高温超快速解冻（50℃以上）等解冻方式[9]，不同畜种冷冻精液的解冻温度又各有不同。目前猪的冷冻精液报道的最低解冻温度为37℃，最高解冻温度为70℃[10]，而牛的冷冻精液可以在90℃高温下解冻[11]。尽管有不少研究认为，高温超快速解冻效果较好[12]，但需要精确控制时间，且因为猪人工授精所需精子量通常在40 亿～80 亿，而常用的0.25 mL 和0.5 mL 规格冻精一支仅含1 亿～2 亿精子，因此一次配种需要同时解冻多份冷冻精液，难以保证解冻时间的一致性，很容易因时间控制不精确而烫伤精子[13]，因此不建议在实际生产中使用高温超快速解冻[14]。本试验中3 种不同解冻液的不同解冻温度和时间的解冻曲线不能完全分离，表明32～52℃是一个较为温和的温度范围，能够获得较为稳定的解冻效果。本研究中，解冻精子的各项性状并没有随着不同解冻温度和解冻时间而表现出规律性的上升或下降。此外，本研究发现，猪冷冻精液解冻后精子指标快速下降，至1 h 左右时下降到最高水平的60%左右，而置于17℃保存精液24 h 后精子各项指标较1 h 更高，因此猪冷冻精液解冻后应当快速使用，当不能立即使用时，最好保持在17℃放置更有利于精子活力的维持[15]。

3.2 不同解冻液最适解冻温度和时间的筛选方法构建猪精液解冻后，通常并不能即刻输入母猪体内，且精子在母猪生殖道仍然需要时间运动到合适位置，因此解冻后精子需要维持一定的活率和活力[16]。针对部分条件较差的猪场，往往还需要解冻后进行一段时间的运输，因此可能需要短期储存。为评价猪冷冻精液保存效果，将冷冻精液解冻后的最高活率所对应的精子活力、快速前进运动精子和慢速解冻精子定义为即时精子指标；将17℃保存24 h 的精子活率和活力记为保存指标；记录10 个不同解冻时间对应高于40%活率数，和活力高于30%数，记为持续指标。由于本研究中所用猪冷冻精液解冻后在17℃继续保存24 h 后的精子活率和活力已经很低，快速运动精子数和慢速运动精子数比例更低，会导致误差较大，且现有标准和评价指标重点关注猪精子活力[17]，未对本研究涉及其他指标做要求。因此，本研究模型中未将这些指标纳入分析，后续如果有需要可以将这些指标一并纳入分析。

经计算分析发现，解冻液M 和J 的最适解冻方式为42℃ 20 s；解冻液C 的最适解冻方式为32℃ 20 s，利用通过因子分析计算得到的最适解冻温度和时间进行解冻，发现解冻后的精子指标在3 种解冻液之间的差距进一步缩小，各指标进一步提升，表明使用通过综合分析筛选最佳解冻程序后可进一步挖掘解冻液潜力。

4 结论

本研究结果表明，利用不同解冻液在解冻荣昌猪冷冻精液时具有不同的最适解冻温度和时间，解冻液M和J 最适解冻方式为42℃ 20 s；解冻液C 最适解冻方式为32℃ 20 s。针对不同解冻液最佳解冻程序不同，通过综合分析可进一步发掘解冻液潜力，降低生产浪费并提升经济效益。