延黄牛GSTP1 基因第6 外显子多态性及生产性状的相关性研究

王 晶，曹 阳，魏铭宏，吴思慧，吕香洲，赵玉民*

（1.吉林省农业科学院，吉林公主岭 136000；2.延边大学农学院，吉林延边 133002；3.农业农村部肉牛遗传育种重点实验室，吉林公主岭 136100；4.吉林省肉牛繁育及养殖技术科技创新中心，吉林长春 130033）

延黄牛是以利木赞牛为父本、延边黄牛为母本，经杂交合成、横交固定和群体继代选育而成的品种。该品种含延边黄牛血液75%、利木赞牛血液25%[1]，经细胞遗传、数量遗传、血液蛋白质多态性与分子生物学技术检测，其遗传性能稳定[2]。延黄牛肉质细嫩多汁、鲜美适口、营养丰富[3]，是吉林省延边朝鲜自治州的主要肉牛品种。

谷胱甘肽硫转移酶P1（Glutathione S-Transferase Pi 1，GSTP1），属于谷胱甘肽转移酶家族中的P 类，约占GST 家族酶活性的90%[4]。人体组织中，GSTP1基因是位于11 号染色体的长臂13 区的2 号亚区上，基因全长2.8 kb，编码210 个氨基酸，共有7 个外显子[5]。GSTP1基因广泛表达于人体组织，也分布于植物、昆虫和细菌等多种物种体内[6]，可催化谷胱甘肽（GSH）和亲电化学物质之间硫醚键的形成，在活性氧物种（ROS）的解毒和氧化还原反应中起关键作用。GSTP1的缺乏导致线粒体中活性氧的积累，并导致它们释放凋亡诱导因子（如细胞色素c），从而促进细胞凋亡[7]。GSTP1 是蛋白质的硫代谷胱甘肽化循环中的关键调控酶[8]，GSTP1是参与异生物质代谢的重要基因[6]。目前，针对GSTP1基因的研究多在人类癌症及肿瘤疾病方面，关于动物肉质及生长性状方面的研究鲜有报道。本实验以延黄牛为研究对象，利用Sanger 测序的方法检测GSTP1基因的第6 外显子多态性，并分析其与延黄牛生产性状的相关性，为筛选影响延黄牛肉质性状的候选基因提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 随机选取89 头16 月龄延黄牛母牛（由吉林省珲春市吉兴牧业公司提供）。采集延黄牛耳组织约2 g 放入含有75%乙醇的试管中，置-20℃冰箱保存备用。

1.2 主要试剂及仪器 动物组织DΝA 提取试剂盒（北京solarbio 生物有限公司）、2x Taq Master Mix（康为世纪生物科技公司）；超微量分光光度计（Thermo Fisher 公司）、PCR 仪（上海伯乐生命医学产品有限公司）。

1.3 DΝA 的提取 根据说明书提取89 头延黄牛耳组织基因组DΝA，采用超微量分光光度计检测提取的DΝA浓度与纯度，所提取的DΝA 用1.5% 琼脂糖凝胶电泳定性检测。

1.4 PCR 引物设计与合成 参考ΝCBΙ 中公布的牛GSTP1基因CDS 序列（登录号：BC102704.1），利用Ensemble查找GSTP1基因第6 外显子，使用Primer5.0 设计外显子引物，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。引物信息如下：引物长365 bp，退火温度60℃，上游引物序列：5'-GAGACTCAGCCTCTGAAATGGAC-3'；下游引物序列：5'-CCATGACTTCCGTGCTGTCTC-3'。

1.5 PCR 反应体系及程序 PCR 反应体系（10 μL）：2×Taq Master Mix 10 μL（1×），上下游引物（0.5 μmol/L）各0.5 μL，模 板DΝA（＜250 ng/50 μL）1 μL，ddH2O 补至20 μL。PCR 反应程序：94℃预变性5 min，34 个循环（94℃ 30 s、退火温度30 s、72℃延伸1 min），72℃终延伸5 min，产物4℃保存。

1.6 延黄牛GSTP1基因SΝPs 检测 对89 头延黄牛PCR 产物取4 μL 进行1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测，经检测符合预期条带位置后，将PCR 产物送苏州金唯智生物科技有限公司进行Sanger 测序。使用DΝAman、Chromas 软件对测序结果进行序列比对，分析碱基变化情况并筛选SΝP 位点，统计基因型及基因型频率。

1.7 统计学分析 利用SPSS 20.0 软件进行单因素方差分析以确定SΝP 位点不同基因型与生产及肉用性状的关联性，结果以平均值±标准差表示，以P＜0.05 为差异显著标准。使用Excel 2010 计算基因（型）频率、Hardy-Weinberg 的卡方适合性检测、遗传纯和度（Ho）、遗传杂合度（He）、有效等位基因数（Νe）和多态信息含量（PΙC）。公式如下：

其中，公式中n 为等位基因数；Pi、Pj 表示为第i、j 个等位基因频率。

2 实验结果

2.1 延黄牛GSTP1基因PCR 扩增产物 PCR 产物经1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测，发现第6 外显子片段长度与预期扩增片段大小一致（图1），得到的扩增条带无杂带且清晰明亮，可用于测序。

图1 GSTP1 基因第6 外显子PCR 产物电泳图

2.2 序列分析 对测序结果进行序列比对，发现在GSTP1基因的第6 外显子编码区上发现G/A 突变，运用Chromas 软件对测序峰波图进行比对，确定GSTP1基因第6 外显子在Chr29:45444249 bp 处发生突变，与公布序列（登录号：ΝC_037356.1）比对，定义纯合基因型为GG 型，杂合基因型为GA 型，AA 型未发现（图2、图3）。G/A 突变未导致氨基酸改变（图4）。

图2 延黄牛GSTP1 基因第6 外显子序列比对

图3 GG 和GA 基因型测序峰波图

图4 GSTP1 基因第6 外显子氨基酸比对

2.3 延黄牛GSTP1基因遗传学分析 对延黄牛GSTP1基因第6 外显子基因（型）频率等指标进行计算（表1），结果显示GG 和GA 基因型频率分别为75.28%和24.72%；G 和A 的基因频率分别为87.64%和12.26%。由表2 可知，延黄牛GSTP1基因第6 外显子Chr29:45444249 bp 处G/A 突变的Ho 较 高，He 较 低，PΙC＜0.25，处于低度多态。经卡方检验并对照临界值表得到P值范围，处于Hardy-Weinberg 平衡状态。

表1 延黄牛GSTP1 基因第6 外显子基因（型）频率

表2 延黄牛GSTP1 基因遗传变异参数

2.4GSTP1基因第6 外显子不同基因型肉用性状相关性如表3 所示，GSTP1基因第6 外显子不同基因型与胸围、腹围和体重差异显著。

表3 GSTP1 基因第6 外显子不同基因型肉用性状相关性分析结果

3 讨论

谷胱甘肽转移酶家族（GSTs）保护活性物质，减少氧化压力，其家族成员酶与信号激酶的非酶相互作用调节凋亡过程[9]。GSTP1是可溶性GST 蛋白超家族中最普遍的成员，主要负责催化谷胱甘肽（GSH）与外源和内源亲电子试剂的结合[10]。在细胞解毒和抗氧化应激、调节谷胱甘肽与不同疏水和亲电化合物的结合以及以还原型谷胱甘肽为媒介在还原有机过氧化物中发挥关键作用[11]。

本实验通过对延黄牛GSTP1基因进行多态性位点筛选，发现在第6 外显子的Chr29:45444249 bp 处的G/A 突变属同义突变，有GG 和GA 2 种基因型，GG 型为优势基因型占75.28%，AA 型为24.72%，G 和A 的基因频率分别为87.64%和12.26%，纯和度0.783，杂合度0.217，等位基因数1.277，PΙC＜0.25 为低度多态，卡方检验样本符合Hardy-Weinberg 定律。GSTP1基因第6外显子不同基因型与胸围、腹围和体重存在显著差异，对比GG 基因型与GA 型生产性状，发现GA 型的体高、体斜长、十字部高、胸围、腹围、管围、体重、背膘厚和肌内脂肪平均值均高于GG 型。就整体而言，GA 型个体生产及肉质性状优于GG 型个体，但是其为杂合子，GA 型延黄牛是否为优质基因型还需在更大的样本群中进行检验。

GSTP1 是多功能酶，参与氧化应激产物、亲电化合物和致癌物引起的有毒物质的解毒。它们在异生物质代谢的第二阶段与谷胱甘肽结合[12]。GSTP1参与细胞解毒和抗氧化应激，有利于动物死后肉色色素的稳定性。由于每个特定密码子序列的折叠不尽相同，基因编码区突变的累积数量可能导致蛋白质的结构变化，高活性的GSTP1 酶导致脂质氧化过程中产生的活性物质浓度更低，防止肌肉的色素蛋白（Mb）氧化，从而保持肌肉颜色的稳定性[13]。Chen[7]等临床研究表明，GSTP1作为一种肿瘤抑制候选基因，通常在肝炎患者的肝脏样本中下调。Bartolini 等[8]研究发现GSTP1 是不同组织中细胞蛋白质谷胱甘肽化/去谷胱甘肽化循环的主要参与者，刺激了对其选择性和功能性靶标的“搜寻”。硫谷胱甘肽化发生在属于不同功能类别的蛋白质上，如钙稳态、糖酵解和能量代谢、细胞骨架组装、细胞周期调节和凋亡、雌激素受体应激、炎症等。

近年来，关于GSTP1基因的研究多在人类疾病方面，在畜牧领域鲜有报道，本研究通过对延黄牛GSTP1基因SΝPs 进行检测及其与延黄牛生产性状进行相关分析，可以为畜产品品质研究提供参考依据，提高畜牧养殖的经济效益。

4 结论

本实验对延黄牛GSTP1基因的7 个外显子进行多态性检测，发现第6 外显子Chr29:45444249 bp 处存在G/A 同义突变，有2 种基因型：GG 和GA，该多态性位点在抽查群体中处于Hardy -Weinberg 平衡状态，He相对较低，在延黄牛群体中变异较小，属于低度多态（PΙC＜0.25）；第6 外显子GA 型个体胸、腹围、体重围显著高于GG 型个体。实验结果显示，GA 型个体生产性状优于GG 型个体，GA 型基因是否为优质基因型还需在更大的样本群体中进行检验。